云南省大理州恙虫病调查研究

关键字：  恙虫病 
　　大理州位于云南西部，地处东经98°52′～101°03′、北纬24°40′～26°42′，辖12个县市。大部份属滇西纵谷地区，境内重峦叠嶂，江河纵横，群山环抱着盆地、湖泊，为金沙江、澜沧江、怒江和红河四大水系的分水岭地带。属亚热带、暖温带高原季风气候。年平均气温15°C，年均降雨量848.4mm，年均相对湿度66%。大理州为云南省最早证实有恙虫病自然疫源地的地区［1］。本文对从大理州分离的部份恙虫病立克次体株进行了比较系统的生物学特性研究，同时对1992～1997年间的恙虫病病人血清进行了血清学分型，结果如下：
　　1　材料与方法
　　1.1　病原体分离及其免疫血清　由我所工作人员到各疫点采集鼠类、急性期病人血及恙螨标本，经分类、鉴定后，按常规方法接种小白鼠，逐日观察发病情况，濒死时解剖、涂片，Giemsa染色镜检立克次体，病原体阳性者，制备小白鼠免疫血清。
　　1.2　免疫荧光试验　采用卫生部北京生物制品研究所提供的Karp、Kato和Gilliam三型抗原片，按常规方法进行，血清由1∶50始作倍比稀释，判定标准参照F.Bozeman氏［2］法。同时，设正常抗原对照和阴性对照。
　　1.3　毒力测定(LD50)　将各分离株悬液稀释成10-3、10-4、10-5、……10-9不同稀释度，分别腹腔接种4只小白鼠，每只0.5ml，观察30天，病死者解剖、涂片、镜检立克次体。
　　1.4　交互保护力试验　将D鼠19、D鼠27和D恙31三个分离株小白鼠脾肾及腹水悬液分别皮下接种20g小白鼠，每只0.25ml，6天后给予氯霉素口服，连续给药5天，停药2天后再继续给药2天。经免疫的小白鼠每4只为一组作试验组。将上述3株立克次体悬液分别稀释成10-1、10-3和10-53种浓度，分别接种用同型和异型株免疫的小白鼠，每只接种0.5ml，同时用4只未经免疫的小白鼠作对照。观察3周，死亡者解剖、镜检立克次体，6日内死亡者作非特异性死亡处理。
　　1.5　发热病人血清　主要由当地卫生防疫部门提供，部份为大理州、市医院送检的疑似恙虫病病人血清。
　　2　结果
　　2.1　病原体分离及其免疫血清分型结果
　　2.1.1　病原体分离　从65组接种材料中分离到22株恙虫病立克次体。其中，从病人分离到6株，从黄胸鼠分离到7株、从斯氏家鼠分离到1株、从褐家鼠分离到2株，从地里纤恙螨分离到6株。
　　2.1.2　免疫血清分型　对22个分离株中的15株小白鼠免疫血清进行分型，结果6株为Karp型、7株为Gilliam型、2株分型阴性。表明黄胸鼠是当地恙虫病立克次体最主要的贮存宿主、次为褐家鼠，地里纤恙螨是最主要的传播媒介。而分离株型别主要是Gilliam型和Karp型，以前者稍多，此外尚有2株分型阴性，是否属于与国际标准型别有差异的抗原型，有待进一步研究。
　　2.2　病人血清分型结果　对大理州199份恙虫病病人血清进行分型，结果120份为Karp型（占60.3%），40份为Gilliam型(占20.1%)，31份为Karp＋Gilliam两型混合感染(占15.6%)，3份为Kato型（占1.51%），3份为Karp＋Kato＋Gilliam3型混合感染（占1.51%），2份为Karp＋Kato两型混合感染（占1.01%）。表明当地恙虫病流行型别以Karp型为主，次为Gilliam型和Karp＋Gilliam两型混合感染，同时亦有少量的Kato型存在。
　　2.3　对实验动物的致病性
　　2.3.1　对小白鼠的致病性　所有分离株均能引起小白鼠发病、死亡。对D鼠19、D鼠27、和D恙203个分离株的研究表明小白鼠病死率达98.8%；发病时间最短5天，最长18天，一般约8～10天；病死的小白鼠均有不同程度的皮下充血、肝、脾及淋巴结肿大，约10%小白鼠产生腹水，70%的病死的小白鼠腹膜涂片可查到立克次体。D鼠19可使小白鼠发生严重黄胆，脾肿尤为明显，可达正常体积的8倍之多。尽管小白鼠对各分离株均非常敏感，除D恙20连续传至66代未丧失毒力外，其余2株均出现不同程度的毒力减弱或丧失，甚至出现不能致死小白鼠的情况。
　　2.3.2　对豚鼠的致病性　用D鼠19、D鼠27株感染豚鼠，所有豚鼠均有不同程度的发热、体重下降，解剖时可见皮下充血、肝脾及淋巴结肿大、腹水。个别豚鼠可发生死亡。腹膜及脾涂片可见立克次体。病理切片标本显示心、肺、肝、脾、肾的细胞浊肿，小血管严重充血及炎性细胞浸润，脑、淋巴结及睾丸亦有类似变化。
  　2.3.3　对家兔的致病性　以D鼠14株的小白鼠脾悬液接种于家兔眼房内及睾丸内，接种后2～3天可见家兔角膜充血、闭目、流泪等；体温于接种后第4天升至42.2℃，睾丸红肿、质硬；发病1个月后处死，后弹性膜及睾丸鞘膜涂片染色，均未见立克次体；其血清作外斐氏试验，OXk为1∶160。以D鼠27株感染的小白鼠悬液于大腿内侧皮下接种0.3ml、腹腔接种1.0ml感染2只成年家兔，其中1只于接种后第4天在皮下接种部位出现黄痘大小、中心凹陷、边缘红晕隆起的溃疡，色灰白，2天后溃疡加深，色稍黑，继之形成黑色硬壳、干燥（焦痂）。第9天体温上升至40℃，1天后下降，3天后体温正常，兔血清CF滴度为1∶128。另1只家兔于接种后第8天体温达40℃，次日降至正常水平，未出现焦痂，可能与个体差异有关。
　　2.3.4　对恒河猴的致病性　选用D恙20强毒株小白鼠悬液感染2只恒河猴，每只腹腔内接种1.0ml、腋下及腹股沟皮下各接种0.25ml。1只猴子接种后体温无明显变化，活动正常，第3天皮下接种部位微红、有硬结。第8天采血并将血块接种小白鼠，分离到立克次体，血清补体结合试验（CF）滴度为1∶32，之后该猴原因不明死亡。另1只感染后第4天活动减少、食欲下降、左眼出现结膜剌激症状，3天后消失。体温于接种后第8日达38.8℃，持续5天后逐渐下降。皮下接种部位红肿。于感染后第14天和第18天采血感染小白鼠均分离到立克次体。CF效价感染前为1∶8，感染后第10、22、53及83天分别为1∶128、1∶128、1∶64和1∶32。
　　2.4　部份分离株对小白鼠的半数致死量（LD50）测定及其免疫血清分型　分别对分离自鼠类的7株和分离自恙螨的3株共10株恙虫病立克次体进行LD50测定，6株为强毒株，4株为中等毒力毒株。同时，对其中6个分离株的小白鼠免疫血清进行IF分型。 
　　2.5　不同抗原型立克次体株间的交互保护力试验　对D鼠19、D鼠27和D恙31株恙虫病立克次体免疫小鼠，用同型株和异型株立克次体悬液进行攻击，另设未免疫小鼠作对照，结果经免疫的小白鼠无论对同型株或异型株均有很强的保护力，至少能耐受105～106个LD50的攻击，但D鼠19株对同型株免疫小鼠的攻击出现不规律死亡，其他实验组亦有个别鼠死亡现象，详见表3。这些死亡鼠经解剖有明显的脾肿、轻度皮下充血及淋巴结肿大，未查见立克次体，这种现象可能与小白鼠的个体差异有关。
　　3　讨论
　　大理州自1956年在云龙县证实有恙虫病自然疫源地以来，现已从永平、漾濞、合庆、弥渡、宾川等县分离到恙虫病立克次体，1994年袁庆虹等［3］证实宾川县亦存在恙虫病自然疫源地。
　　云南恙虫病立克次体对实验动物的致病性的研究已早有报告［4］，并根据对豚鼠的致病性、小白鼠传代试验和鸭胚适应发育以及家兔、猴子的致病性和毒力测定结果，推断其较闽株强而较广株弱，近似于东南亚地区的热带种。对大理州10个分离株的实验研究结果表明，4株为中等毒力毒株、6株为强毒株，其中毒力最强的D鼠27株LD50为9.0。在大量的小白鼠传代中，小白鼠病死率达98%以上；对豚鼠有较强的致病力；对家兔亦有一定的致病性，个别株可使家兔皮下接种部位形成焦痂；而恒河猴感染后未出现明显的临床变化，可能与猴种的敏感性有关。研究表明，大理州恙虫病立克次体分离株的毒力普遍较强，而小白鼠则是分离恙虫病立克次体最理想的实验动物。
　　用3株经定型的立克次体进行交互保护力试验，结果表明不同抗原型恙虫病立克次体之间有很强的交护保护力’与于恩庶等［5］和冯慧敏等［6］报告的结果基本一致，此结果可以解释在多抗原型流行区中，人群重复感染恙虫病极为少见的原因。
　　对分离株的分型结果表明，其型别主要是Gilliam型和Karp型，以前者稍多，但未发现不同材料来源与血清型别之间有任何关系，亦未发现血清型别与毒力强弱存在相关性。
　　从病人血清分型结果来看，199份病人血清中Karp型占60.3%，是最主要的流行型，次为Gilliam型（占20.1%）和Karp＋Gilliam两型混合感染（占15.6%）。与对分离株分型结果略有差异，可能是因分型的分离株数量较少之故。对各分离株分型，低滴度时型别交叉较为严重，但不断稀释后，都能将其分开，但在病人血清中，则出现两型、甚至3个型不能分开的现象，可能系重复感染（隐性感染）另一型别所致。