人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定

随着人类基因组计划的初步完成,确定不同发育阶段的功能基因成为后基因组时代的重要研究内容,而构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一,在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7为表达载体,构建了一个人正常胃黏膜细胞全长cDNA 表达文库,为今后胃疾病相关基因的研究工作奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人GES?1细胞于2009年6月18日购自中南大学湘雅中心实验室。Trizol提取试剂购自美国Invitrogen公司;质粒小量提取试剂盒、PCR TaqMix试剂盒、Oligotex?dT30 mRNA Purification kit购自大连宝生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。护理论文发表

　　1.2 方法

　　1.2.1 总RNA提取及poly(A)+RNA纯化 细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。培养至旺盛生长期,倾尽培养液后直接向培养瓶中加入Trizol试剂(1 ml/10 cm2),裂解细胞,并用吸头将细胞裂解物吹吸几次,再经氯仿抽提及异丙醇沉淀后,以75%乙醇洗涤,室温自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP处理),并在55～60℃放置10 min让其充分溶解。取出一小份稀释后在紫外分光光度计下测RNA含量及纯度,并做琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性。以Oligotex?dT30 mRNA Purification kit进行mRNA分离纯化,实验步骤按说明书进行。

　　1.2.2 第一链cDNA 的合成 将模板RNA(Poly(A)+ RNA)5 μg中加入H2O,使其总量达到9.8 μl,于72 ℃孵育2 min,冰中放置2 min后在微量离心管中加入5×1st Strand Synthesis Buffer 4 μl、1st Strand dNTP Mixture 1.2 μl、RNase Inhibitor(20 U/μl)1.0 μl、1 μg /μl Oligo(dT)18 Anchor Primer[序列为5'?(GA)10ACTAGTCTCG?AG(T)18V?3'(V:A or C or G)]2.0 μl于室温放置10 min后加入Reverse Transcriptase(M?MLV)1.0 μl,轻轻混匀,于 42 ℃孵育60 min,向反应管中加入200 U/μl SuperScript III RTase 1 μl,52 ℃孵育60 min,反应结束后置于冰中冷却2～5 min.

　　1.2.3 双链cDNA合成 在第一链cDNA合成液(20 μl)中加入5×2nd Strand Synthesis Buffer 30 μl、2nd Strand dNTP Mixture 4.5 μl、RNase?free H2O 87.5 μl、E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 2 μl、E.coli DNA PolymeraseⅠ2 μl.用移液枪轻轻混匀后,16 ℃反应2 h,70 ℃加热10 min,室温放置5 min,加入4 μl的T4 DNA Polymerase轻轻搅拌,37 ℃反应10 min.经PCI抽提、CI抽提后,加入3 M Sodium Acetate(pH5.2)15 μl,Dr.GenTLE Precipitation Carrier 3 μl,100%乙醇400 μl,立即进行室温下15 000 r/min共30 min的离心。除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5 μl的 RNase?free H2O溶解沉淀。

　　1.2.4 cDNA与sal Ⅰ adaptor的连接 向上述双链cDNA溶液3.5 μl中加入下列试剂:10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μl,0.4 μg/μl EcoR I Adaptor 3.5 μl,350 U/μl T4 DNA Ligase 1 μl,10 mm Ratp 1 μl,全量为10 μl.轻轻混匀,8 ℃过夜反应,70 ℃保温30～45 min,室温放置5 min.

　　1.2.5 限制酶XhoI酶切反应 向Adaptor Ligation溶液中加入:10× H buffer 5 μl,50 U/μl Xho I 3 μl,轻轻混匀,37 ℃反应3 h.护理论文发表

　　1.2.6 使用Spin Column除去短链cDNA及文库构建 单链(single strand,ss)cDNA 扩增后合成双链(double strand,ds)cDNA,ds?cDNA经XhoⅠ酶切及柱层析洗脱,收集0.5～5 kb 之间的组分,在T4DNA 连接酶作用下,与pGADT7去磷酸化臂于16 ℃水浴中过夜连接,随后包装蛋白包装载体。

　　1.2.7 文库滴定、重组率测定和扩增 按照构建的cDNA 文库滴度文库滴定公式[2]:原始文库滴度=克隆斑总数×稀释倍数×包装体积,重组率测定采用蓝白斑筛选方法,即向含有酵母菌和E.coli.XL1?Blue 混合液的上层琼脂中分别加入50 μl 100 mmol/L的IPTG 和X2Gal,于90 mm 平板上铺板,置37 ℃孵育过夜,分别计算蓝色斑和无色斑数,重组率=无色噬菌斑数/(无色噬菌斑数+蓝色噬菌斑数),随后进行文库的扩增。

　　1.2.8 cDNA文库质量鉴定 取扩增后的cDNA 文库铺板,随机挑取16个克隆斑行PCR 扩增,以载体克隆位点两端的序列设计引物(引物合成公司为大连宝生物工程有限公司):引物1:5'?GGAGTACCCATA?CGACGTACC?3'及引物2:5'?TATCTACGATTCATCTGCAGC?3',反应条件为:95℃预变性1 min,于95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃3 min循环30周,最后于72 ℃延伸10 min.1% Agarose Ge电泳,检测Insert DNA的片段长度。

　　2 结果与分析

　　2.1 总RNA的制备和mRNA的分离纯化

　　提取的总RNA于紫外分光光度仪检测吸光度OD=A260/A280=1.92,于10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S、5 S 3条清晰带,28 S∶18 S 约为2∶1(图1),纯化后的mRNA于10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示为为0.5～5 kb 的片状条带,说明所提取的mRNA质量较纯。
2.2 cDNA 文库的构建

　　poly(A)+ RNA经逆转录及扩增后,于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,ds?cDNA在0.4～5 kb之间形成一片状条带,经酶切及柱层析洗脱后,收集长度在0.5 kb 以上的组分,经乙醇沉淀浓缩后,溶于7 μl 去离子水中,取3 μl 于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,显示为长度在0.5～4 kb 的一片状条带(图2),即可与载体pGADT7连接。构建的文库经效价测定,文库的克隆数为4.00 ×106 pfu/ml,以蓝白斑筛选检测重组率> 95 %,文库经扩增后,滴度达9.50×109pfu/ml.

　　2.3 cDNA 文库的质量鉴定

　　随机挑取16个克隆斑,以载体克隆位点两端引物进行PCR 扩增插入的cDNA 片段,以琼脂糖电泳检测扩增产物,结果显示,cDNA 插入片段长度均在500～2 000 bp(图3)。

　　3 讨论护理论文发表

　　目前,构建全长cDNA文库的方法主要有以下几种:Oligo?capping法[3],CAP ture法[4],SMART法[5?6],Cap?Select法[7],Cap?jumping法[8]以及Cap?trapper法[9]等。 所有的这些方法都着眼于真核生物mRNA 5'端的帽子结构,但又各有其独到之处.总的说来,cDNA文库构建大致经分离总RNA,纯化mRNA,反转录成cDNA,然后与两端带有限制性酶切位点的人工接头相连接,并将其插入到载体中,转染大肠杆菌,得到cDNA文库。而酵母菌可替代大肠杆菌作为受体菌克隆真核基因。酵母菌属真核单细胞生物,基因组仅为大肠杆菌的4倍,但它却可以像原核细胞一样进行实验操作。因此,酵母菌是遗传工程中用于表达真核细胞基因较理想的受体细胞[10]。

　　成功地构建一个全长cDNA 文库,关键问题是要分离得到高质量的mRNA,并且mRNA种类越多,cDNA 文库就越完整。导致RNA质量不高的原因主要有两个:一是总RNA有降解,在琼脂糖凝胶电泳上表现为28 S与18 S条带模糊,呈弥散状,5 S条带出现高浓度。我们所提取的RNA在琼脂糖凝胶电泳上表现为28 S、18 S、5 S 3条清晰条带,其中28 S∶18 S 约为2∶1,说明RNA没有降解。二是RNA的污染,提取的RNA于紫外分光光度计检测A260/A280比值在1.90～2.1时,RNA质量较纯。A260/A280值低,说明有较多的蛋白质污染。这些蛋白质可严重降低逆转录酶的催化效率。我们所提取的RNA经检测,A260/A280值为1.92,说明所提取的RNA较纯。

　　在cDNA 文库构建完成之后,一般需对载体中插入片段的大小进行检测。本研究得到了插入子片段,成功地进行了cDNA 文库的鉴定。插入片段长度在500～2 000 bp之间,且长度并不均一,说明我们所构建的文库具有一定复杂性。

　　我们运用此方法构建了高效的富集全长的人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库,经滴度测定、重组率、PCR 鉴定均符合cDNA 文库的质量要求,可以对其进行随机挑选克隆测序分析,并可在以后的工作中利用酵母双杂交方法寻找引发胃疾病的相关基因。
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