姜黄素脂质体的制备及其体外抗脂质过氧化的研究

医学研究表明,许多疾病与自由基和脂质过氧化密切相关,如癌症、自身免疫性疾病、糖尿病和衰老等[1]。为了抑制自由基的产生和脂质过氧化,尤其是在人体的保护系统功能减弱时,常需要提供外源性抗氧化剂,用于阻断自由基对细胞的氧化性损伤,保护人体细胞。

　　姜黄素(curcumin)是姜科姜黄属(Curcuma longa L.)植物姜黄、莪术、郁金根茎中分离出的活性物质之一,具有广泛的药理作用如抗炎、抗氧化、清除自由基及抗肿瘤等[2]。但姜黄素不溶于水,在人体内生物利用度低,且在中性和碱性的环境中易降解,给临床应用带来很大的局限性[3]。脂质体作为药物载体,可明显改善药物的水溶性、增强靶向性、提高药物稳定性和降低药物毒性[4]。因此将姜黄素包裹在磷脂双分子层中,可降低姜黄素与水分散相及外界环境的接触,提高了姜黄素的稳定性,使其更好地发挥其抗氧化抗自由基的作用。

　　1 仪器与材料论文发表网

　　高效液相色谱仪(日本岛津);UV2000紫外分光光度计(上海尤尼柯有限公司);旋转蒸发仪(上海医械专机厂);姜黄素(Sigma,含量95%);注射用大豆磷脂(上海太伟药业);葡聚糖凝胶G?50(Pharmacia);混合纤维素滤膜(上海市新亚净化器总厂);胆固醇(广州南方玻化进口分装);硫代巴比妥酸(中国上海化学试剂公司);三氯乙酸(天津科密欧化学试剂开发中心);其他试剂均为色谱纯。Wistar大鼠(沈阳药科大学动物中心)。

　　2 方法和结果

　　2.1 分析方法的建立

　　2.1.1 色谱条件 色谱柱:C18柱Diamonsil(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈?2%冰醋酸(58∶42);流速:1.0 ml/min;柱温:室温;检测波长:426 nm;进样量:20 μl.方法学考察结果表明:在本色谱条件下,脂质体中的辅料对姜黄素的测定无干扰[5]。色谱图见图1.

　　2.1.2 线性关系的确定 配制质量浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/ml的一系列姜黄素对照品溶液。按上述色谱条件进样,以峰面积和质量浓度进行线性回归,得回归方程A=6.45×104C+8.15×103(R2=0.9998),在1.0～64.0 μg/ml浓度范围内线性关系良好,且精密度和回收率均符合分析要求。

　　2.2 姜黄素脂质体的制备

　　精密称取注射用大豆卵磷脂、胆固醇、姜黄素置于茄形瓶中,加入无水乙醇使脂质完全溶解。将茄形瓶置旋转蒸发仪上,50 ℃减压蒸发溶剂,使脂质溶液形成一层均匀薄膜,然后真空干燥过夜,使溶剂除尽。加入磷酸盐缓冲液(PBS pH 6.5)10 ml水化,水化液经0.8、0.45、0.22 μm滤膜高压挤出,得姜黄素脂质体混悬液[6]。

　　2.3 脂质体包封率的测定

　　采用微柱离心法测定姜黄素脂质体的包封率[7]。制备5 ml葡聚糖凝胶微柱,依次用PBS(pH 6.5)和0.5 ml空白脂质体饱和微柱,2 000 r/min离心3 min,弃去洗脱液。取0.3 ml姜黄素脂质体3份上样,以等体积PBS(pH 6.5)洗脱,2 000 r/min离心3 min连续操作3次。平行测定3批。将离心液用甲醇破坏,流动相定容。按“2.1.1”中色谱条件进样,按EE=Wdrug/Wtot×100%计算脂质体的包封率。

　　2.4 正交试验优化姜黄素脂质体处方论文发表网

　　单因素考察确定了薄膜分散法制备姜黄素脂质体的一些条件,在单因素考察的基础上,进行正交设计试验优化姜黄素脂质体处方。

　　2.4.1 因素和水平的选择 在单因素考察的基础上,确定制备温度50 ℃,以包封率EE为指标,确定磷脂浓度(A)、药脂质量比(B)、磷脂和胆固醇质量比(C)及介质种类(D)4个对包封率影响较大的因素作为考察因素,每个因素设3个水平,见表1.表1 因素与水平

　　2.4.2 正交试验结果分析 选用L9(34)正交表可得9组处方,以最佳制备工艺制得姜黄素脂质体,分别测定其包封率,正交试验设计优化薄膜分散法制备姜黄素脂质体的处方结果见表2.根据正交试验表,从极差R来看,各因素对包封率的影响大小次序为:B>C>A>D.在试验所选的范围内,水相介质对包封率的影响最小,药脂比对包封率的影响最大。根据实验结果,并综合考虑药物稳定性和经济,调整处方,最后选定磷脂浓度为4%(g/100 ml),磷脂与胆固醇质量比为20∶1,磷脂与药物的质量比为20∶1,水化介质为pH 6.5磷酸盐缓冲液。表2 正交试验设计优化薄膜分散法制备姜黄素脂质体的处方按照正交设计最优化所得到的处方制备3批脂质体,按“2.3”中方法测定脂质体的包封率,结果见表3.表3 姜黄素脂质体的包封率(n=3)

2.5 姜黄素脂质体对大鼠组织脂质过氧化的影响

　　2.5.1 大鼠组织的处理 将大鼠断头处死,迅速取出心、肝、肾和脑,用生理盐水清洗,除去血液。分别称取大鼠组织500 mg,用组织剪剪碎,置于匀浆器,加入生理盐水研成5%组织匀浆液。

　　2.5.2 大鼠组织的过氧化反应 取各组织匀浆液3 ml,加入姜黄素脂质体0.4 ml,对照管加等量生理盐水,振荡温育(37±0.5)℃ 6 h.取出后加入15%三氯醋酸1 ml,充分混匀,3 000 r/min离心15 min,取上清液3 ml,加入0.8%硫代巴比妥酸液1 ml,混匀后置沸水浴中加热10 min,冷却至室温[8]。

　　2.5.3 大鼠组织匀浆脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定 取适量上述所得到的氧化液,以去离子水作为参比,于分光光度计532 nm 处测吸收值A532,以摩尔消光系数ε= 1 156 ×105 L/(mol·cm)计算MDA的浓度(μmol/L)并按下式计算抑制率[4,9]。抑制率=[1?含抗氧化剂的样品中MDA的浓度(μmol/L)/空白样品中MDA的浓度(μmol/L)]×100%,结果见表4.表4 姜黄素脂质体在体外对大鼠组织脂质过氧化的抑制率

　　2.5.4 姜黄素脂质体的加入量对脂质过氧化的影响 按“2.5.3”中方法测定姜黄素脂质体的加入量对大鼠各组织匀浆MDA生成的影响。从表5可以看出,在试验范围内,随着姜黄素脂质体加入量的增加(0.1～0.5 ml),姜黄素脂质体对大鼠各组织匀浆自发氧化生成MDA均有较好的抑制效果,体系中MDA的清除率随姜黄素脂质体加入量的增加而升高。表5 姜黄素脂质体的加入量对脂质过氧化抑制率的影响论文发表网

　　3 讨论

　　葡聚糖凝胶微型柱离心法操作简便,能实现游离药物与脂质体的分离,故采用此法测定姜黄素脂质体的包封率。以最佳处方制得的姜黄素脂质体的包封率较高,进一步证明了姜黄素具有较强的脂溶性,与磷脂双分子层结合紧密。

　　脂质过氧化反应的产物丙二醛等可导致人体细胞氧化损害、老化、癌变等。而姜黄素是具有邻二羟基基团的酚类抗氧化剂,在抗氧化过程中会产生稳定性很好的醌类物质,既可以抑制膜磷脂过氧化,也可抑制水溶性自由基产生剂引发的脂质过氧化。同时姜黄素有很强的供氢能力,提供的氢能与脂肪酸自由基结合,使其还原,中止自由基的连锁反应,从而防止脂质自动氧化[10]。

　　由姜黄素抗氧化试验结果可知,姜黄素对心、肝、肾、脑等组织脂质过氧化有明显的抑制作用,其中对脑的脂质过氧化抑制率最高,且随着姜黄素用量的增加,抗氧化能力增强。有相关报道,姜黄素对脑部疾病如老年痴呆、帕金森综合征有效,并有利于防病治病和延缓衰老,这可能与姜黄素的抗自由基抗氧化作用密切相关[11]。姜黄素作为一种良好的抗氧化剂,以脂质体的方式给药,有助于增加膜磷脂对氧化损伤的抗性,使膜磷脂更稳定，且对组织脂质过氧化也有明显的对抗作用,临床上可用于肿瘤,免疫功能低下,心血管疾病等的辅助治疗[12]。
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