CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用

【摘要】  　　目的 构建CD59突变的重组体，研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase?3表达的变化。方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术，将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸，克隆入pALTER?MAX质粒，采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞。G418筛选稳定表达细胞克隆，用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株，用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase?3表达的变化。结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒。转染突变CD59后Hela细胞内caspase?3表达明显减少，与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义（t=2.846,P<0.01)。结论caspase?3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径。 
【关键词】  抗原 CD59 点突变 肿瘤逃逸 基因重组 Hela细胞 Caspase 3 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊
　　［ABSTRACT］ Objective To construct mutant CD59 molecular, and study the alleosis in the expression of caspase?3 correlative with tumor apoptosis brought about by CD59 mutation in Hela cells. Methods Using polymerase chain reaction site?directed mutagenesis, the amino acid of the 39th and the 41th mutated to tryptophanes. Mutant CD59 DNA  inserted into the vector pALTER?MAX and transfected into the Hela cells via lipofectamine method. Stable expression clones were selected by the addition of G418. The G418?resistant clones which expressed relatively high levels of mutant CD59 were sorted by immunofluorescence method, ELISA and flow cytometry. The expression of caspase?3 in Hela cells before and after transfection was tested immuno?histochemically. Results Recombinant plasmids of pALTER?MAX?CD59 had been successfully constructed according to sequence of enzyme digestion analysis and fragment investigation. The amount of caspase?3 in Hela cells which were transfected was obviously lower than that in Hela cells which were transfected with nomal CD59, and the difference was obvious (t=2.846,P<0.01). Conclusion Another way by which CD59 leads the tumor escaping may be the expression changing of caspase?3.
    
　　［KEY WORDS］ Antigens, CD59; Point mutation; Tumor escaping; Mutagenesis; Hela cells; Caspase?3
    
　　众所周知，肿瘤的免疫逃逸是导致治疗方案失败的重要原因[1]。至今为止，国内外学者对肿瘤逃逸的机制已有多方面的阐述。近年来，国外学者在肠道、卵巢及前列腺等多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的高表达。CD59是一种补体调节蛋白,其以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚着于多种细胞膜表面[4]，通过阻止补体攻膜复合物(MAC)的装配保护宿主细胞免受补体介导的溶细胞作用[5,6]。近年来的研究显示，CD59与肿瘤的生长失控和转移密切相关[2,3]，但有关其与肿瘤逃逸的相关性研究目前尚未有定论。本文通过研究caspase?3的表达变化，探讨CD59与肿瘤逃逸的相关活性位点，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。
　　1  材料和方法
　　1.1  材料
    
　　pALTER?MAX、pALTER?CD59由美国哈佛大学惠赠, EcoR Ⅰ酶、DNA聚合酶、T4连接酶均购自大连TaKaRa公司，细菌菌株E.coli.JM109为本室保存，小牛血清为天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品，Trypsin（1∶250）购自Sino?American Biotec公司，RPMI 1640培养基、G418选择抗生素、LipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品，鼠抗人CD59单抗为本实验室制备，羊抗鼠IgG2a?FITC、羊抗人CD59单抗和HRP标记兔抗山羊IgG（H+L）均购自北京中山生物技术有限公司，荧光抗体CD59?FITC购自COULTER 公司，caspase?3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Hela细胞由本实验室保存。设计两对寡核苷酸引物，通用引物：pT7，T3；突变引物：M/F，M/R。以上引物均购自上海生物工程有限公司。
　　1.2  方法
　　1.2.1  重组真核表达载体的构建  在原构建的重组质粒pALTER?CD59的基础上, 设计两对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物，由生物公司合成。其序列如下。通用引物pT7：5′?TAATACGACTCACTATAGGC?3′；通用引物T3：5′?TATTCAGGCGTAGCAACCAG?3′ ；突变引物M/F：5′?GTGTATAACAAGTGGTGGTGGTTTGAGCAT?TGC?3′； 突变引物M/R：5′?ATGCTCAAACCACCACCACTTGTTATACACTTG?3′。 以已构建的CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物pT7和诱变引物M/R进行PCR1反应，以已构建CD59 cDNA重组质粒为模板，以常规引物T3和诱变引物M/F行PCR2反应，将纯化PCR1和PCR2产物等量混合为模板，以通用引物pT7和T3行PCR扩增反应，从而得到所需的诱变位点的大量DNA片段，该突变可使CD59第39～41位氨基酸均突变为色氨酸。经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切后，经T4 DNA连接酶作用，使突变基因插入到pALTER 质粒的EcoR Ⅰ位点, 以构建重组真核表达质粒。用TSS法使重组质粒转化感受态的细菌JM109，经氨苄青霉素筛选后，挑取单个菌落用酚抽提法提取质粒，以EcoR Ⅰ酶切鉴定。对筛选的克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。
　　1.2.2  Hela细胞的转染及阳性克隆的筛选  重组质粒的转染参照 LipofectamineTM2000的说明书进行。转染后24 h，将细胞按1∶10稀释传代，24 h后加入含有800 g/L G418的选择性培养基，筛选2周后套取单克隆并继续筛选2周，扩大培养始终维持G418在400 g/L。连续传代10次后，收集细胞进行鉴定。
　　1.2.3  Hela细胞中突变CD59的检测  ①免疫荧光技术: 刮取细胞, 离心去上清, 用PBS洗3次。涂片、干燥后, 用乙醇固定后晾干, 加入鼠抗人CD59单克隆抗体，37 ℃孵育30 min, 洗涤后加入羊抗鼠的FITC?IgG二抗，于37 ℃孵育30 min，洗涤，干燥后在荧光显微镜下观察结果。②ELISA法：收获并裂解细胞,测定并调节标本和对照蛋白质质量浓度为5 mg/L,用包被液以1∶1、1∶2、1∶4 稀释待测标本和空白PALTER 对照,并分别设6个复孔,每孔加入100 μL样品,4 ℃包被18 h,封闭,加入鼠抗人CD59抗体后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,然后加底物显色液（邻苯二胺）显色,测定495 nm处吸光度（A）值。③流式细胞术：刮取转染突变CD59的细胞株(5×108/L)，加入FITC?抗人CD59单克隆抗体，设置野生Hela细胞为对照，实验组及对照组均设定FITC?IgG二抗，同型对照，上机检测。
　　1.2.4  肿瘤逃逸相关分子caspase?3的检测  用免疫组织化学法检测转染突变CD59后Hela细胞内caspase?3表达的变化，操作按照caspase?3免疫组化试剂盒使用说明书进行。用Imagepro?plus 5.0软件对所得图片进行吸光度测量。
　　1.3  统计学处理
    
　　数据间比较采用t检验。
　　2  结果
　　2.1  重组质粒的鉴定
    
　　以EcoR Ⅰ酶对重组质粒进行酶切,获得1条496 bp的电泳带,与所插入的片段的大小相一致(图1)。测序结果表明,突变CD59?pALTER含有突变CD59的全长cDNA序列。见表1。
　　2.2  荧光免疫组化检测
   
　　荧光显微镜下可见转染突变CD59的Hela细胞表面的荧光亮度明显强于未转染突变CD59的Hela细胞。
　　2.3  ELISA检测
    
　　转染突变CD59的Hela细胞裂解产物的CD59蛋白表达量明显高于Hela对照组，差异有显著性（t=3.195～4.842,P<0.01）。见表2。
　　2.4  流式细胞术检测
    
　　转染突变CD59的Hela细胞的CD59表达率为78.32%（图2）。
　　2.5  转染前后Hela细胞内caspase?3的表达变化

转染突变CD59后Hela细胞的平均吸光度值为0.189±0.029，转染正常CD59的Hela细胞的平均吸光度值为0.202±0.031,两者比较，差异有显著性（t=2.846,P<0.01）。
　　3  讨论
    
　　CD59是一种GPI蛋白，可以作用于补体激活终末阶段的MAC的形成，使肿瘤细胞免受补体介导的溶细胞作用从而引起肿瘤逃逸。目前已有研究显示,CD59分子中N37～H44位基因突变可导致糖尿病的发生,其NMR结构显示抗补体活性区域也主要集中于N37～H44之间[7]。肿瘤逃逸相关活性位点虽然尚未有明确定位,但无疑为寻找该活性位点提供了理论性的指导，从而引导我们发现肿瘤逃逸中可能存在的其他途径。 
　　表1  突变人CD59与野生型人CD59的差别（略）
    
　　表2  ELISA实验结果（略）
　　与野生Hela细胞比较，*t=3.195～4.842,P<0.01
　　图1  重组质粒鉴定结果
    
　　①DNA Marker;②酶切的重组突变CD59质粒;③未经酶切的突变CD59重组质粒AB
　　图2  流式细胞术检测结果（略）
　　对于类似p53编码基因等抑癌基因的研究显示， 肿瘤的发生与肿瘤细胞丧失了正常的凋亡机制有关[8]。近年来的研究还显示，在一些药物诱导的细胞凋亡中，存在caspase?3的活化[9，10]。本课题组已有研究成果显示，CD59基因突变使凋亡相关因子caspase?3表达发生变化。
    
　　caspase?3是细胞凋亡过程中的关键分子。 细胞凋亡需经两条不同的途径:一条是Fas与细胞表面的死亡受体FasL结合后,首先激活caspase?8,然后再活化下游的caspase(主要为caspase?3);另一条是各种毒性物质通过刺激线粒体释放的细胞色素C激活caspase?9后,活化下游的caspase(主要也为caspase?3)，这两条途径均需激活caspase?3。因此，通过使CD59的活性位点突变以影响其抗补体活性，并且通过影响caspase?3的表达，进而影响肿瘤细胞的凋亡可能成为肿瘤治疗的新方法。
    
　　本研究成功构建了CD59可疑活性氨基酸突变的重组体，使CD59第39～41位氨基酸均突变为色氨酸；Hela细胞转染突变的CD59后凋亡相关因子caspase?3的表达量显著减少。说明CD59分子的色氨酸在突变CD59蛋白发挥抗肿瘤逃逸作用时充当重要角色，提示CD59引起肿瘤逃逸的另一途径可能是通过使凋亡相关因子caspase?3的表达减少，使细胞凋亡减少，从而引起肿瘤细胞逃脱机体的免疫监视而实现的。
    
　　综上所述，可以通过封闭CD59的活性位点，减弱CD59分子中的活性氨基酸的功能，提高caspase?3活性使肿瘤细胞凋亡，同时减低其抗补体活性来促使肿瘤细胞不能逃避免疫杀伤，从来达到治疗肿瘤的目的。本研究将为肿瘤靶向治疗提供一条新思路，具有重要临床应用价值。
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