蝙蝠葛酚性碱对BXPC?3裸鼠抑瘤作用及对VEGF表达的影响

1 材料与方法

　　1.1 动物

　　裸鼠,体重18～22 g,雌雄各半,由黑龙江中医药大学安全性评价中心提供,合格证:SCXK(京)2007?0001.裸鼠自由进食、饮水,在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心无菌条件下饲养。

　　1.2 药物与试剂

　　蝙蝠葛酚性碱(PAMD),黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供,含量为83%,用时先以1 mol/L HCl溶解,再用1 mol/L NaOH调pH值至中性,加蒸馏水至所需浓度。实验时临时配制成溶液;注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide For Injection),江苏恒瑞医药股份有限公司,批准文号:国药准字H32020857;生理盐水,哈药集团制药六厂,批号:071003B11.硕士论文发表 

　　胰腺癌瘤株BXPC?3由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供。VEGF兔抗鼠多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体HRP多聚体、SP?9003检测试剂盒、PV?6001两步法检测试剂盒、DAB显色剂均由南京建成生物技术有限公司生产。

　　1.3 主要实验仪器

　　生物组织包埋机(湖北孝感);电热恒温箱培养箱DPX?9162B?1;轮转式组织切片机俫佧2135型;研究用生物显微镜Olympus BX60;电子天平(AL204,METTLEY TOLEDO,Switzerland);超净工作台BIOLOGICAL Safety Cabinets Class Ⅱ Nikon digital camera DXm1200F H?Ⅲ?E600;格兰仕中型机型微波炉WP700.

　　1.4 动物模型的构建

　　取冻存的胰腺癌细胞株BXPC?3,立即投入37 ℃水中,1 min内融化,然后离心去冻存液,用约10倍的冷RPMI1640完全培养液洗1次,接种于培养瓶,待细胞贴壁后更换培养液。将肿瘤细胞株培养在RPMI1640完全培养液中,置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中,隔日换液,细胞长成单层后,用0.25%胰酶EDTA消化、传代。待细胞进入对数生长期后,收集细胞并用RPMI1640完全培养基调整浓度为5×106个/ml的细胞悬液备用。在无菌条件下接种于40只裸鼠右腋窝皮下,每只鼠接种0.2 ml(含瘤细胞数1×106个).

　　1.5 分组及给药方法

　　裸鼠40只造模后随机分为5组,每组8只,分别为蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组及阳性对照组、模型对照组。各组均腹腔注射给药,每日给药剂量为蝙蝠葛酚性碱高剂量20 mg/kg,中剂量10 mg/kg,低剂量5 mg/kg,模型对照组每日给予同等容积生理盐水,阳性对照组注射用环磷酰胺156 mg/kg(每周给药1次),连续21 d.

　　1.6 实验指标的检测方法硕士论文发表 

　　停药后次日称取小鼠体重,脱椎处死小鼠,取瘤块称重,计算抑瘤率。免疫组化法(SP)检测肿瘤组织VEGF表达情况,检测以细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞,同一显微镜倍数(×40)观察全片,确定肿瘤浸润边缘。然后选择5个高倍(×400)视野,取所分析的5个不同视野染色细胞平均百分数及平均染色强度评分,评分标准按Mattern[3]的方法进行:根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度,染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级,阴性为0分;阳性细胞1%～25%为1分;阳性细胞26%～50%为2分;阳性细胞51%～75%为3分;阳性细胞76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级:无色为0分;弱阳性(黄色)为1分;中等强度(棕黄色)为2分;强阳性(棕褐色)为3分,两者得分相加为最后评分。

　　1.7 统计方法

　　抑瘤实验结果以±s表示,组间比较用t检验。免疫组织化学结果采用秩和检验计算,以P <0.05为差异具有统计学意义。
2 结果

　　2.1 蝙蝠葛酚性碱对BXPC?3裸鼠的体内抑瘤作用

　　表1实验结果表明,蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组和环磷酰胺对照组同模型组比较,对BXPC?3实体瘤均有不同程度的抑制作用,抑瘤率分别为34.91%,52.83%,41.51%,55.66%,并与模型组比较其差异有统计学意义(P <0.01)。表1 蝙蝠葛酚性碱对BXPC?3裸鼠抑瘤作用结果(n=8)

　　2.2 蝙蝠葛酚性碱对BXPC?3裸鼠瘤组织中VEGF表达的影响

　　表2免疫组织化学结果显示:VEGF在模型组瘤组织呈高表达,各实验组和阳性对照组肿瘤组织VEGF的表达水平均较模型组有所降低;其中中剂量组和环磷酰胺组的VEGF表达水平显著降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);高剂量和低剂量组也能降低VEGF的表达,与模型组比较差异有统计学意义(P <0.05)。表2 蝙蝠葛酚性碱对BXPC?3裸鼠肿瘤VEGF表达水平的影响(n=7)

　　3 讨论

　　蝙蝠葛酚性碱对肿瘤的作用日渐被人们所关注,单保恩等[4]证实PAMD对多种不同组织来源的肿瘤细胞(上皮源性、血源性、腺源性)具有广谱的抑制作用。本实验抑瘤实验结果显示:PAMD高、中、低剂量组的平均瘤重均明显低于模型对照组(P <0.01),抑瘤率分别为34.91%、52.83%、41.51%,抑瘤率均大于30%,可初步认为PAMD对胰腺癌细胞株BXPC?3裸鼠皮下异位移植瘤有一定的抑制作用。

　　1971年,Folkman[5]最早提出了肿瘤生长依赖血管新生的假说,在许多肿瘤组织中VEGF呈高表达,并且其表达水平的高低与肿瘤的某些生物学行为有密切关系[6]。VEGF作为一种生长因子,由于具有促进多种细胞生长和繁殖以及促血管生成等作用,与肿瘤的生长、增殖密切相关[7?8]。大量临床研究显示VEGF的高表达与肿瘤微血管密度、恶性程度、患者预后不良密切相关[9?12]。提示两者及其受体可作为抗血管生成以治疗胰腺癌的靶点,或监测疗效的指标。本实验结果表明:蝙蝠葛酚性碱能够下调BXPC?3裸鼠肿瘤组织中VEGF表达水平,说明蝙蝠葛酚性碱可能是通过抑制VEGF的表达从而抑制肿瘤血管生成来实现抑瘤作用。硕士论文发表