前列腺癌特异突变DNA聚合酶β表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化

随着生活方式的改变及人口的老龄化，前列腺癌(PCa)发生率呈显著增长趋势〔1〕。关于PCa发生的确切分子机制尚未阐明。目前认为DNA损伤及修复失灵在肿瘤发生发展过程中起重要作用。DNA聚合酶β(polβ)是参与DNA合成和修复的重要酶类，维持基因的稳定性〔2～5〕。前期研究证实：国人PCa组织和人PCa PC3细胞株中存在polβ基因的多种错义突变形式和突变位点〔6〕。基于人PCa polβ基因的特异突变形式和位点，又成功构建了2个PCa特异突变polβ真核表达载体(pcDNA3.1?M1和pcDNA3.1?M2)〔7〕。本研究拟将这些表达载体转染NIH3T3细胞，观察这些突变形式对细胞polβ基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养 小鼠成纤维细胞系NIH3T3购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。常规细胞培养。细胞转染按Invitrogen公司转染试剂LipofectamineTM操作说明书进行，采用G418筛选阳性克隆。

　　1.2 重组载体 PCa特异突变polβ表达载体pcDNA3.1?M1(768 nt C→T和801 nt A→G点突变，导致219位 Gln→终止码);PCa特异突变polβ表达载体pcDNA3.1?M2(388nt A→G和1071nt T→C突变，导致92位 Asp→Gly和320位 Phe→Leu);野生型polβ表达载体pcDNA3.1?W，均由本室构建〔7〕。

　　1.3 RT?PCR检测人或鼠polβ的mRNA表达 人polβ mRNA检测：上游引物5′TGTTTGCCAGCTTCCCAGTA3′(824～843)，下游引物 5′CTCCAGTGACTCCCAAGGGA 3′(1 029～1 010)，扩增片段长度206 bp。鼠polβ mRNA检测:上游引物5′TGTTTGCCAGCTTCCCAGCG 3′ (751～770)，下游引物 5′CTCCAGTGACCCCCAGGGGG 3′(956～937)，扩增片段长度206 bp。人及鼠均采用的内参照GAPDH引物:上游引物5′ATCACCATCTTCCAGGAGCG3′(250～269)，下游引物5′ACGTCAGATCCACGACGGAC3′ (769～750)，扩增片段长度520 bp。用Qiagen公司试剂盒提取细胞总RNA并经逆转录得 cDNA。扩增反应体积为30 μl：cDNA 5 μl，Mix (含有人或鼠polβ引物及GAPDH内参照引物)6 μl，Taq酶0.5 μl，去离子水18.5 μl。94℃预变性 5 min，94℃变性50 s，55℃复性50 s，72℃延伸60 s，三温循环35次，72℃末端延伸5 min。

　　1.4 流式细胞仪检测细胞周期的变化 取汇合度达80%～90%的细胞，常规消化，PBS洗两遍。2%多聚甲醛1 ml固定5 min，离心，PBS再洗一遍。加A液(胰蛋白酶)250 μl/ml样品，轻混，室温放置10 min。加B液(中和液)200 μl/ml样品,轻混，室温放置10 min。加C液(PI染料)200 μl/ml样品,轻混，2～8℃避光放置10 min。用300目尼龙网过滤样品后上机，图像分析采用Cell Quest软件。资料用Madfit LT for Mac 3.0软件分析处理。

　　1.5 Western 印迹检测polβ蛋白表达水平 收集各组细胞，超声破碎细胞，Bradford测定蛋白含量，取适量样品，进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;电转到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉4℃封闭6 h;TTBS洗膜5 min×3次。加入一抗工作液(polβ1∶200) 室温孵育1 h。TTBS洗膜5 min×3次，室温。加入碱性磷酸酶标记的相应的二抗抗体 (1∶500)平缓摇动孵育1 h，室温。TTBS洗膜5 min×3次。加入BCIP/NBT显色液，避光30 min后，蒸馏水终止。

　　1.6 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验检测自发突变率 将5×105个待测细胞(转染和未转染的NIH3T3细胞)接种于培养瓶中，于37℃，5%CO2培养24 h。进入指数生长期后，胰酶消化，加入含10%血清培养液，混匀，放入离心管以1 000 min离心5 min，弃去上清液，制成细胞悬液并计数。以6×106 个细胞接种于直径为100 mm的平皿中，培养基中含有5 μg/ml的6?TG(6?硫代鸟嘌呤)，37℃，5%CO2培养7 d，平行作10个平皿。将上述首次消化计数后的细胞每平皿接种200个，培养基中不含6?TG，平行作10个平皿，37℃，5% CO2条件下同样培养7 d。培养结束后，用3∶1乙醇?冰醋酸固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。计算自发突变率。自发突变发生率=突变集落数/接种细胞数×1/集落形成率。

　　1.7 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件。数据以x±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用方差分析。
2 结 果

　　2.1 重组PCa特异突变polβ的表达载体转染NIH3T3细胞 转染后首先用400 μg/ml的G418筛选，1～2 d后细胞大量死亡，仅余少量细胞，G418改为维持浓度200 μg/ml，经过2～3 w逐渐形成抗性克隆，扩大培养得到稳定转染pcDNA3.1?M1、pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞。教研论文发表

　　2.2 重组PCa特异突变polβ表达载体转染NIH3T3细胞polβ mRNA的表达 见表1，转染pcDNA3.1?W、pcDNA3.1?M1、pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞中均检出高水平的人polβ 的mRNA表达，而转染空质粒pcDNA3.1和未转染的NIH3T3细胞中，均未检出人 polβ mRNA表达，说明转染表达成功。另外，上述5种细胞鼠polβ mRNA表达水平一致，说明转染并未影响NIH3T3细胞本底 polβ的mRNA表达。表1 RT?PCR检测NIH3T3细胞内 polβ mRNA表达

　　2.3 重组PCa特异突变polβ表达载体转染NIH3T3细胞polβ蛋白表达水平 见图1。未转染及转染空载体的NIH3T3细胞，在39 kD均有一弱蛋白印迹，系NIH3T3细胞自身表达的polβ。转染野生型polβ载体(pcDNA3.1?W)的NIH3T3细胞，在39 kD处可见明显的杂交印迹，说明转染pcDNA3.1?W的NIH3T3细胞高效表达外源polβ。转染PCa特异突变polβ载体(pcDNA3.1?M1)的NIH3T3细胞，在26 kD处,可见明显的杂交印迹，缘于pcDNA3.1?M1表达的是含有2个突变位点(768 nt C→T，801 nt A→G)的polβ基因，导致219位 Gln→终止码，表达仅含219个氨基酸的polβ的截短蛋白，说明转染pcDNA3.1?M1的NIH3T3细胞亦高效表达外源性polβ，在39 KD处还有一弱蛋白印迹，系NIH3T3细胞本身表达的polβ。转染pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞，在39 kD处可见明显的杂交印迹，说明转染pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞亦高效表达外源性的polβ。1：转染pcDNA3.1?W的NIH3T3细胞;2：转染pcDNA3.1?M1的NIH3T3细胞;3：转染pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞;4：转染空pcDNA3.1的NIH3T3细胞;5：未转染的NIH3T3　图1 PCa特异突变polβ表达载体转染NIH3T3的polβ蛋白表达

　　2.4 转染重组PCa特异突变polβ表达载体的NIH3T3细胞周期的变化 见表2。与未转染和转染空载体的NIH3T3细胞相比，转染野生型polβ的细胞株和转染PCa特异突变polβ的2个细胞株，细胞周期S期比例均显著性增高(P<0.05)。且转染野生型polβ较之转染PCa特异突变polβ的2个细胞株的S期比例亦显著增加(P<0.05)。表2 PCa特异突变polβ转染NIH3T3对细胞周期的影响

　　2.5 转染重组PCa特异突变polβ表达载体的NIH3T3细胞的自发突变率变化 见表3。使用poisson分布的u检验分析显示，与未转染和转染空质粒的(pcDNA3.1)的NIH3T3细胞相比，转染野生型polβ和转染PCa特异突变polβ的2个细胞株的自发突变率均显著性增加(P<0.05);且转染野生型polβ细胞的自发突变率亦显著高于2种PCa特异突变polβ转染的细胞(P<0.05)。表3 PCa特异突变polβ表达载体转染NIH3T3细胞的自发突变率变化

　　3 讨 论

　　研究揭示，PCa组织及人PCa PC3细胞株存在polβ的多种突变形式和突变位点〔6〕。本课题组针对有意义的polβ突变形式和位点，采用基因克隆技术，成功构建了两个PCa polβ特异突变形式的真核表达载体pcDNA3.1?M1和pcDNA3.1?M2。本研究结果显示，转染pcDNA3.1?W、pcDNA3.1?M1、pcDNA3.1?M2的NIH3T3细胞，较之未转染及转染空质粒的NIH3T3细胞，均检出高水平的人polβ mRNA表达，而上述5种不同类型的细胞中鼠polβ mRNA表达水平一致。Western印迹检测亦表明，转染pcDNA3.1?W的NIH3T3细胞高效表达外源polβ蛋白，转染2种PCa特异突变polβ载体(pcDNA3.1?M1、pcDNA3.1?M2)的NIH3T3细胞，亦高效表达外源PCa突变polβ基因相应的polβ缺陷蛋白。另外基于NIH3T3细胞株的polβ系野生型，不存在polβ基因变异，因此本研究揭示外源性polβ转染表达并未干预NIH3T3细胞自身polβ的表达，即与细胞内源性polβ表达无关。

　　高效表达外源polβ蛋白的细胞亦引发细胞周期的变化。结果显示，转染PCa突变型polβ的2个细胞株和转染野生型polβ的细胞株，细胞周期S期比例均明显增高。且转染野生型polβ的细胞株较之转染PCa特异突变polβ的2个细胞株的S期比例亦显著增加。本研究还利用体外哺乳类细胞次黄嘌呤?鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变试验，对外源野生、PCa特异突变polβ转染NIH3T3细胞的致基因突变作用进行了评价。结果显示：与未转染和转染空质粒的NIH3T3细胞相比，转染野生型polβ和PCa特异突变polβ细胞的HGPRT基因的自发突变率均显著升高，且转染野生型polβ的细胞的自发突变率亦显著高于转染PCa特异突变polβ的细胞。教研论文发表

　　综合研究结果显示，野生型抑或PCa突变型polβ转染NIH3T3细胞，在不干扰细胞polβ本底表达的状况下，均可高表达外源型polβ。又基于NIH3T3细胞的polβ与人的polβ高度同源〔8，9〕，理论上外源型polβ表达叠加了转染细胞的polβ本底表达，使外源型polβ总酶绝对量和活性较之未转染外源polβ的NIH3T3细胞为高，从而改变了细胞内不同种类DNA聚合酶的正常功能分布和活性状态，使得本来主要呈现DNA损伤修复酶活性的polβ，可因细胞内polβ的高比例存在可取代其他种类的DNA聚合酶而更多地发挥其作为次要功能的聚合酶活性而参与DNA的复制。但由于polβ缺乏DNA复制的即时校读功能〔10〕，复制的保真性最低，因此可能是造成高表达外源polβ的细胞遗传不稳定性增加，细胞周期S期比例增加及基因自发突变率升高的分子机制。转染PCa特异突变polβ的细胞虽亦呈现相应的polβ蛋白的表达，但因其空间构象发生改变，酶活性尤其是参与复制的C端的聚合酶活性受到一定程度影响，故参与低保真性并直接影响基因组稳定性的DNA复制的几率减少。而转染野生型polβ的细胞所高效表达的polβ蛋白却能有效的参与低保真度复制，又基于NIH3T3细胞自身有完备的polβ表达和修复酶功能呈现，不依赖外源表达的polβ修复酶功能，很可能是导致转染野生型polβ细胞的自发突变率高于转染PCa特异突变polβ细胞的缘由，该结果进一步佐证了polβ的高表达介导细胞遗传的不稳定性和突变表型形成等细胞生物学行为变化的分子机制。