正交实验法优选沙枣花总黄酮提取工艺及沙枣花醇提物体外抗氧化活性的研

沙枣花为胡颓子科植物沙枣 Elaeagnusan-gustifolia L .的花,主产于西北地区，在宁夏地区资源非常丰富。据《中药大辞典》记载,沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发油 ,具有止咳平喘的功能 ,可用于治疗慢性气管炎[1]。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成分[2]，但也有人初步研究了青海省沙枣花黄酮类物质的提取方法[3] ，已有人利用沙枣花提取液中的功能成分黄酮类化合物对羟基自由基进行了清除试验研究，发现沙枣花中的黄酮类化合物对羟基自由基有着较好的清除效率[4],本实验观察了AE-EAB对氧自由基的清除作用，发现AE-EAB对氧自由基有清除作用，并随着浓度的升高而增强。本文以提取物中总黄酮含量为指标,采用正交实验设计和紫外分光光度法对沙枣花中总黄酮的提取条件及含量测定进行了系统的研究,为进一步开发利用沙枣花及沙枣资源提供科学依据。

　　1仪器与试药

　　1.1仪器旋转蒸发仪(上海亚荣); SHB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ-3200 DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Mili-Q超纯水仪(法国);电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);7225N分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。

　　1.2药材与试剂沙枣花采自宁夏医学院旁沙造林，经宁夏区药品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树Elaeagnus angustifolia L.的新鲜花序。水为超纯水, 其它试剂均为分析纯。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100080)。

　　2方法

　　2.1 分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量[5]

　　2.1.1 对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品50 mg,置于25 ml量瓶中,加甲醇适量,置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1 ml中含无水芦丁0.2 mg)。

　　2.1.2标准曲线的制备精密吸取标准溶液1，2，3，4，5，6 ml置25 ml量瓶中,各加亚硝酸钠溶液1. 00 ml,混匀,放置显色6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程Y=10.316X-0.002 6,相关系数r=0. 999 2,线性关系良好。见表1，图1。表1标准曲线测定数据图1芦丁浓度-吸光度标准曲线

　　2.1.3供试品溶液制备取本品粗粉1 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90 ml，加热回流至提取液无色，转移至100 ml量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。紧密量取3 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。

　　2.1.4稳定性实验精密吸取对照品溶液和供试品溶液各3 ml置25 ml容量瓶,分别按照“2.1. 2”项中“加亚硝酸钠溶液1. 00 ml”起,至“加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置”操作,用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白,分别在2, 5, 15, 30, 45, 60 min测定吸收度,结果表明,对照品吸收度RSD=0.764 (n=6),样品吸收度RSD=4.556,说明稳定性较好。结果见表2。表2稳定性实验结果

　　2.1.5精密度实验精密吸取同一份对照品和供试品溶液各5份,每份3 ml置25 ml容量瓶,按照“2.1.2项中“加亚硝酸钠溶液1. 00 ml”起,至“加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置”操作, 用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白,测定吸收度,结果表明,对照品吸收度RSD=0.185% (n=5),样品吸收度RSD=4.141% (n=5),说明精密度较好。数据见表3。

　　2.1.6重复性实验精密称定同一批沙枣花粉末5份各1.0 g,按照“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液,测定吸收度, 结果表明,RSD=4.214,说明重复性较好。结果见表4。表3精密度实验结果表4重复性实验结果

　　2.1.7加样回收率实验职称论文发表费用

　　取已知总黄酮含量的沙枣花粉末(含总黄酮13.41% )3份,每份1 g,精密称定,然后照“供试品溶液的制备”项下进行制备，制备后各取3 ml，同时分别加入已知浓度的芦丁标准液1.0, 2.0, 3.0 ml，依照上述样品测定的方法测定,求出回收率结果，结果表明, 3次测定的平均回收率为105.0%，(RSD=0.525%，n=3)。说明该测定方法测得的结果准确。结果见表5。表5回收率实验结果

2.2 总黄酮提取工艺研究

　　2.2.1乙醇超声提取法称取沙枣花粉末约1 g,加100 ml 95%乙醇,超声波提1 h,抽滤。滤渣再加100 ml 95%乙醇,超声波提取2.5 h,抽滤,合并两次滤液,减压回收乙醇至滤液仅剩100 ml, 精密量取10 ml,至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3 ml，至25 ml量瓶中，备用。照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。

　　2.2.2乙醇回流提取法称取沙枣花花1 g,加95%乙醇100 ml,煮沸1 h,过滤。药渣再加95%乙醇100 ml,煮沸1 h,过滤。合并2次滤液,减压浓缩至100 ml, 精密量取10 ml,至100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3 ml，置25 ml量瓶中，备用。照“2.1.2”标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。评价二者效果法总黄酮的含量。结果见表6。表6提取方法考察结果

　　2.2.3 正交设计实验

　　供试品制备：称取干燥恒重的沙枣花粉末10 g,共9份按照L9(34)正交设计实验表确定的条件(见表7)以加乙醇量、乙醇浓度、提取时间、提取次数4因素进行超声提取,提取液过滤浓缩后,定容在100 ml量瓶中,取10 ml定容置100 ml容量瓶中，摇匀,作为供试品溶液。供试品溶液中总黄酮的含量测定：精密吸取正交设计中每份供试品提取液3 ml置25 ml容量瓶中, 参照“2.1.2”标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起测定吸光度。结果见表8。运用统计软件DPS v7.05对数据进行分析，结果可知, 因素B差异有显著性(P<0. 05),因素A、因素C、因素D差异无显著性;各因素对总黄酮提取的影响大小分别为B>A>D>C,即乙醇浓度>料液比>提取次数 >提取时间;提取沙枣花中总黄酮的最佳提取条件为A2B2C1D3，即70%的乙醇，料液比1∶20，提取3次，1 h/次。验证实验表明,此方法都有较好的重复性,方法可行L9(34)正交设计实验, 沙枣花总黄酮提取的最佳工艺为A2B2C1D3，即20倍量70%乙醇,回流1 h,回流3次。表7 L9(34)因素水平表8L9(34)正交设计实验结果　　表9总黄酮含量方差分析结果验证实验：按优选的最佳工艺条件制备3份样品。结果见表10。表10验证实验

　　2.3 沙枣花乙醇提取对自由基的清除作用[6]  职称论文发表费用

　　量取pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液5 ml，分别加入原始浓度为0.5，1，2，4，6 mg/ml的沙枣花乙醇提取物溶液0.3 ml，用双蒸水补充至9.7 ml，置于10 ml容量瓶中，混匀，立即加入3 mmol/L的邻苯三酚0.3 ml,迅速摇匀后倒入比色皿中，用10 mmol/L的HCl为空白液，在325nm波长处，每隔30 s测吸光度值1次，以吸光度值A对反应时间t作线性关系图，斜率即为V1,代入式(1),计算出抗氧化剂对超氧阴离子的清除率(Y)。　　Y(%) =(1-V1/V0)×100V0为加入空白溶剂70%乙醇溶液0.3 ml时的斜率。图2沙枣花乙醇提取物清除氧自由基标准曲线从图2中可以看出，沙枣花醇提物对氧自由基有清除作用，并随着浓度的升高而增强，但是清除率较低，可能由于其中的抗氧化物质在总提取物中占取的比例较低。但具体是哪类物质起抗氧化作用，对其中抗氧化物质的筛选有待于进一步的分离得到较纯的组分后再做研究。

　　3结论

　　通过L9(34)正交设计实验，确定了沙枣花总黄酮提取的最佳工艺条件为A2B2C1D3,即20倍量70%乙醇，回流1h,回流3次，并且发现沙枣花乙醇提取物对超氧阴离子具有一定的清除作用。为沙枣花资源的综合利用开发提取理论基础。