雷诺嗪对兔心房肌细胞快钠电流的影响及使用依赖性阻滞作用

雷诺嗪(Ranolazine)是一种新型代谢调节剂，多个临床试验证实其有确实的抗心绞痛作用，且不影响血压和心率，于2006年1月27日正式被美国食品与药品管理局批准用于心绞痛的辅助治疗[1-2]。基础研究发现，雷诺嗪有潜在的抗心律失常作用，作用上类似于胺碘酮。其治疗心绞痛的作用可能主要通过抑制心肌细胞的晚钠电流(INa-L)，减轻细胞内钙超载而实现的[2]。目前关于其对心脏快钠电流(INa)的作用尚存在争议[2-4]。本实验拟应用全细胞膜片嵌记录方法，了解雷诺嗪对兔心房肌细胞INa的影响及其是否存在使用依赖性阻滞(use-dependent)作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  心房肌细胞的分离

　　新西兰纯种大耳白兔6只，雌雄不拘，体重1.5～2kg。采取盐酸氯胺酮(Ketamine)120～160mg/kg体重耳静脉注射麻醉，成功后迅速开胸切取心脏，置于冰冷的无钙台氏液中冲洗，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorff心脏灌流装置上；经主动脉根部逆行用氧饱和的无钙台氏液灌流(20mL/min，恒温37℃)10min，再用含0.4g/L胶原酶I(Sigma公司)、2g/L小牛血清蛋白(Sigma公司)的无钙台氏液反复灌流15～20min，至心脏膨大、松弛后从灌流装置上取下；去除心室肌，加数滴含酶无钙台氏液后将心房肌剪碎成1mm3的组织块，加入含胶原酶I和小牛血清蛋白的无钙台氏液温孵20min；最后过滤离心保存在KB液中备用。

　　1.2  膜片嵌全细胞记录

　　采用标准式全细胞记录。将内冲过电极内液的玻璃微电极(尖端1～2μm，阻抗2～5MΩ)连接于电极支持装置，取上述制备好的心肌细胞悬液数滴滴于灌流槽中，置于生物倒置显微镜下(Olympus，日本)，待细胞沉底附壁后，用钠灌流液灌流，灌流速度2mL/min，冲去死亡细胞碎片，选取表面光洁、横纹清晰的心肌细胞作为研究对象。采用三维液压微操纵器靠近细胞进行封接，封接阻抗1GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。脉冲信号由Digidata 1320A(美国Axon)放大器控制，数据由pClamp8软件采集、分析。数据经计算机自动分析后储存于计算机硬盘中。

　　1.3  药品与试剂

　　雷诺嗪(CV Therapeutics公司，美国)，胶原酶Ⅰ、蛋白酶、EGTA、HEPES均为Sigma公司产品。试剂的配制：①无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 125、KCl 3.5、K2HPO4 1.5、MgCl2 1、NaHCO3 20、HEPES 5，用NaOH调节pH至7.4；②KB液(mmol/L)：L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 80、K2HPO4 20、KCl 20、MgCl2 5、K2EGTA 0.5、Na2ATP 2、丙酮酸(Pyruvic Acid) 5、肌酸(Creatine)5、牛磺酸(Taurine) 20、甘氨酸(Glycine) 10、HEPES 5、Glucose 10，用NaOH调节pH至7.3；③INa电极内液(mmol/L)：NaCl 10、CsF 110、CsCl 20、EGTA 5、HEPES 5、ATP-Mg 5，用CsOH调节pH至7.4；④钠灌流液(mmol/L)：CsCl 130、MgCl2 1.0、NaCl 10、CaCl2 1.0、HEPES 5、Glucose 10、CdCl2 0.3 用CsOH调节pH至7.4。所有实验在室温(20～25℃)下进行。
　
　　1.4  统计学处理

　　采用细胞外给药的方法，给药后5min观察指标的变化。所有统计学处理均应用SPSS11.5软件包进行。计量资料以±s表示，实验在同一细胞进行，用自身对照t检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结 果教育学论文发表

　　2.1  雷诺嗪对INa的影响

　　维持电压(holding potential)在-100mV，指令电压-80mV～+40mV，步长20mV，钳制时间80ms，刺激频率0.5Hz，引出INa；以不同钳制电压下的电流密度绘成电流-电压(Ⅰ～Ⅴ)关系曲线，然后给予30μmmol/L雷诺嗪灌流5min，重复上述操作。30μmmol/L雷诺嗪可显著抑制INa的峰电流，INa电流密度峰值(钳制电位-40mV时)由灌流前的(33.42±4.33)pA/pF(n=6)降至灌流后的(13.4±4.43)pA/pF(n=6，P<0.01)，其IC50为(25.6±1.8)μmmol/L(图1)。

　　2.2  雷诺嗪对INa-T的频率依赖性和使用依赖性

　　INa的使用依赖性测定：保持电位从-100mV～-40mV，给予1Hz、3.3Hz和5Hz不同刺激频率(刺激间期分别1000ms、300ms和200ms)，脉宽10ms，脉冲20个。3种刺激频率在同一细胞完成，给予不同刺激频率时时间隔2min。结果显示，30μmmol/L雷诺嗪灌流后，3.3Hz连续20个脉冲所产生的INa电流呈逐渐减少趋势，最后达稳态水平(图2A)；随着刺激频率的增加对INa电流阻断也加大，说明存在使用依赖性(图2B)；随着药物浓度的增加和刺激频率的加大对INa电流的阻断逐渐加强(图2C)；随着刺激频率的增加对INa电流阻断IC50逐渐减少，说明该药亦存在频率依赖性(图2D)。
　3  讨 论

    雷诺嗪是哌嗪类衍生物。作为脂肪酸部分氧化酶抑制剂，雷诺嗪通过抑制脂肪酸的β氧化，促进由葡萄糖氧化生成ATP，从而减少心肌的氧需求，起到保护心肌缺血的作用。目前，雷诺嗪已作为标准抗心绞痛治疗的辅助用药[1-2]。基础研究显示，雷诺嗪是晚钠电流(INa-L)阻断剂[2]。INa-L 是持续存在于动作电位平台期的一种内向钠离子流。正常情况下INa-L仅占快钠电流的1%，但在某些病理情况如缺血、缺氧时，INa-L可明显增加，导致早后除极引起心律失常。雷诺嗪的离子通道效应类似于长期应用胺碘酮。它明显阻滞心肌细胞I(kr)、晚钠电流、后Ica、I(Na-Ca)和IKs电流，很少或不改变Ito、Ik1电流，从而抑制早后除极、缩小或不改变跨室壁复极离散度而发挥抗心律失常作用[2]，尤其对INa-L的阻断效应也是其抗心肌缺血的机制之一。但雷诺嗪对INa电流的作用尚存在争议。ANTZELEVITCH等[3]报道，雷诺嗪对狗浦肯野氏纤维动作电位Vmax显示浓度依赖性阻止作用，且对INa显示低亲和力作用，其IC50为294μmmol/L，为抑制INa-L的38倍。相反SCHARM等[4]发现，雷诺嗪对狗心室肌细胞的INa无作用。我们的实验发现，雷诺嗪对兔心房肌快钠电流确实有明显的抑制作用，其IC50为(25.6±1.8)μmmol/L。这与以往的报道不同。以上实验结果的差异是动物种属的差异还是心肌异质性所致，值得进一步探讨。正常心房肌和心室肌钠通道存在差异性。BURASHNIKOV等[5]通过对犬心房肌和心室肌全细胞记录发现，心房肌钠通道密度较心室肌明显大[心房：(-89.59±41.05)pA/pF；心室：(-50.20±3.34)pA/pF，P<0.01]，峰电流记录在心房为-25mV，在心室肌为-35mV，半失活电压(V0.5)在心房肌记录比心室肌差16.2mV[心房(-88.80±0.19)mV；心室(-72.64±0.14)mV]。研究亦发现，雷诺嗪对心房和心室的钠通道阻断动力学存在差异，对心房肌选择性更大。给予雷诺嗪15μmmol/L灌流后对心房和心室的半失活电压对心房肌影响更大(13.82～16.57mV)，并且雷诺嗪对心房肌较对心室肌更大程度导致频率依赖性舒张期兴奋阈值增高，可显著性地延长心房复级后的不应期，而对心室肌却无作用[5]。教育学论文发表

    受体调节学说认为，钠通道具静息态、激活态和失活态。当刺激频率越大时，单位时间内通道被激活和失活的次数越多，致药物与钠通道受体作用位点结合的几率增加，从而使钠通道恢复到静息态进入到激活态的量减少，即开放和关闭的次数越多，刺激频率越快，处于激活态和失活态的钠通道越多，而静息态相对减少。因此，作用于激活态或失活态的药物随着刺激频率的加快和通道结合率上升，其阻滞作用加强。此即药物作用的的频率依赖性或使用依赖性[6]。本研究发现，雷诺嗪在快频率时作用更强，存在使用依赖性和频率依赖性，与以往研究结果一致[5，7]。雷诺嗪主要作用于失活态[2]。有研究发现，10μmmol/L雷诺嗪对犬肺静脉肌袖由乙酰胆碱和异丙肾上腺素诱发的触发性心律失常有明显的阻滞作用，并且存在使用依赖性[7]。最近国外报道，用雷诺嗪治疗难治性房颤，其中7例房颤患者均经抗心律失常药物治疗或射频消融治疗后仍反覆发作，停用所有抗心律失常药物3个半衰期后，给予雷诺嗪500～1000mg，每天2次口服，结果4例维持窦律，1例发作间期明显延长，2例无效[8]。结合本研究结果，表明雷诺嗪对心房INa-T电流有明显的阻滞作用，且存在使用依赖性，预示其对快速性房性心律失常有潜在的治疗作用。