辣椒碱纳米乳注射剂的制备及其体外评价

【摘要】  目的 研究辣椒碱纳米乳注射剂的处方和制备工艺，并对其质量进行评价。方法 以外观、粒径、包封率为指标，通过单因素试验筛选处方成分，包括油相、乳化剂、助乳化剂组成及比例，同时优化制备工艺。结果 优选得辣椒碱纳米乳处方组成为：中链脂肪酸三甘油酯∶吐温80∶豆磷脂∶丙二醇的质量比为1.5∶2.5∶1.25∶1.5;所制得纳米乳滴平均粒径6.16 nm，多分散系数0.307，包封率85.22％。结论 制得的辣椒碱纳米乳制备工艺简单，并符合纳米乳主要指标要求。

【关键词】  辣椒碱 纳米乳 粒径 含量测定 包封率

辣椒碱（capsaicin）是辣椒辛辣物质和具有药物活性的主要成分［1］。纯辣椒碱为白色针状晶体，熔点65～66 ℃；易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂及碱性水溶液，但难溶于水。
      　　
　　辣椒碱通过选择性拮抗神经肽P物质，减少炎性介质组胺、缓释肽和前列腺素生成、释放而发挥抗炎镇痛效果［2］，有效治疗带状疱疹后遗症神经痛、糖尿病神经痛、面部神经痛、风湿性关节炎和骨关节炎等疼痛，是新型非成瘾性镇痛药［3］。由于疗效肯定，美国药典24版已经收载。目前，市场上辣椒碱产品主要是皮肤局部用制剂［4?6］，起效慢、药物吸收不完全，且对皮肤刺激性大，病人顺应性较差。
      　　
　　纳米乳（nanoemulsion）是粒径为10～100 nm的乳滴分散在另一种液体中形成的胶体分散系统，属热力学稳定体系［7］。作为一种新型给药系统，纳米乳不良反应小、安全性高，对难溶性药物有较强增溶能力，有效提高药物的生物利用度而受到极大关注［8-11］。因此，本文将辣椒碱制成纳米乳注射剂，以增加辣椒碱的溶解度，减少刺激性，同时通过控制粒径（＜100 nm），避免网状内皮单核细胞吞噬系统（MPS）吞噬而延长辣椒碱体内作用时间，改善辣椒碱生物学性质，最终达到起效快、镇痛时间长、副作用低的目的，为扩大辣椒碱临床应用提供依据。

　　1    仪器与试药

　　1.1    仪器
      　　
　　JB?2型恒温磁力搅拌器（上海智光仪器仪表有限公司），十万分之一电子分析天平（BP211D，德国赛多利斯），F?4500 Hitachi 荧光分光光度计（日本日立公司），Zetasizer Nano ZS 90纳米粒度及Zeta电位分析仪（英国Malvern Instruments Ltd），JEL?IOOCXⅡ透射电镜(日本)，Shimadzu LC?10A 高效液相色谱仪（日本岛津公司），Shimadzu RF?10AXL荧光检测器（日本岛津公司）。

　　1.2    试药
     
　　辣椒碱原料（贵州安顺生达生物科技开发公司，纯度≥97%，批号20030503），辣椒碱对照品（SIGMA 公司，纯度≥97％，批号2069698），中链脂肪酸三甘油酯（MCT，德国 Sasol Germany GmbH，iv 级，批号061224），吐温80（上海申宇医药有限公司，药用级，批号080201），豆磷脂（上海金伴药业有限公司，药用级，批号021109），葡聚糖SephadexG?50（北京拜尔迪生物公司，批号17?0043?02），丙二醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号071012），色谱甲醇（天津四友化学试剂厂），超纯水，其余试剂均为分析纯。

　　2    方法与结果

　　2.1    纳米乳处方筛选

　　2.1.1    纳米乳的制备    称取适量的药物、油、乳化剂、助乳化剂，搅拌混匀，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下将此溶液逐滴加入60～65 ℃蒸馏水中乳化。

　　2.1.2    油、表面活性剂种类    分别以大豆油、MCT、油酸乙酯为油相，吐温80、泊洛沙姆F68、豆磷脂为乳化剂，考察外观及700 nm透光率（此波长药物、辅料自身无吸收，透光率仅与乳滴大小成反比），初步筛选乳剂的组成，结果见表1。结果表明：乳化剂与油的质量比为4∶1时，乳化剂的乳化能力由强到弱排列是：吐温80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂，故选择吐温80为乳化剂；油相被乳化由强到弱排列是：油酸乙酯≈MCT＞大豆油，而MCT已被欧洲药典准许用于注射剂，且已有上市产品［12］436-439，故选择MCT为油相。
　　
　　表1    油相、表面活性剂种类对粒径的影响（略）

　　Table 1    Effect of oil phase and surfactants on particle size

　　2.1.3    表面活性剂用量     吐温80与MCT按不同质量比，分别以4∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1∶1混合，按“2.1.1”项制备，考察外观及700 nm透光率，结果见表2。结果表明：在MCT与丙二醇的量、制备工艺相同前提下，吐温80∶MCT≥2.5∶1时能形成微乳。因此，选择吐温80∶MCT=2.5∶1作为表面活性剂与油最低比例。

　　2.1.4    复合乳化剂比例    固定（吐温80+豆磷脂）∶MCT=2.5∶1，将吐温80与豆磷脂按不同质量比混合，考察方法同“2.1.3”项，结果见表3。结果表明：当吐温80∶豆磷脂≥2∶1时能形成微乳。为减少吐温80的用量，选择吐温80∶豆磷脂=2∶1为复合乳化剂比例。

　　2.1.5    油浓度    固定吐温80∶豆磷脂∶MCT=0.  25∶0.125∶0.15，按“2.1.1”项制备，考察MCT不同浓度时的包封率。由表4可见，辣椒碱纳米乳包封率随MCT浓度的增大而相应提高，当MCT浓度上升至1.50%，包封率为85.22%，符合药典的相关规定（包封率＞80%）。

　　2.2    纳米乳制备工艺优化

　　2.2.1    乳化温度选择    将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按处方量混匀，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液，在磁力搅拌下将此溶液分别逐滴加入60～65 ℃与常温（25 ℃）蒸馏水中乳化30 min。辣椒碱纳米乳包封率结果见表5。结果表明：60～65 ℃乳化的包封率略高于常温乳化。为简化生产工艺，选择常温（25 ℃）乳化。

　　表2        油与表面活性剂比例对粒径的影响（略）

　　Table 2    Effect of the proportion between oil and surfactants on particle size

　　表3    复合乳化剂比例对粒径的影响（略）

　　Table 3    Effect of the proportion of composite emulsifiers on particle size

　　表4    油浓度对辣椒碱纳米乳包封率的影响（略）

　　Table 4    Effect of oil concentration on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

　　2.2.2    油、水滴加顺序    将药物、油、复合乳化剂、助乳化剂按“2.2.1”项制备均匀透明的溶液，在磁力搅拌下，分别将此溶液逐滴加入25 ℃蒸馏水中，以及将25 ℃蒸馏水一次倾入该溶液中乳化30 min，包封率结果见表6。结果表明：油、水滴加顺序对包封率影响不大。考虑今后工业生产更简单，选择蒸馏水一次倾入油中乳化的方式。

　　表5    温度对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）

　　Table 5    Effect of temperature on entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

　　表6    制备工艺对辣椒碱纳米乳包封率影响（略）

　　Table 6    Effect of preparation technology on entrapmentefficiency of capsaicin nanoemulsion

　　2.3    辣椒碱纳米乳注射剂的制备
     
　　依据辣椒碱纳米乳处方设计与工艺研究结果，结合注射剂的制备工艺，拟定辣椒碱纳米乳注射剂制备工艺如下：按处方量称取辣椒碱、油、乳化剂、助乳化剂，50 ℃水浴加热溶解，得均匀透明的溶液；在磁力搅拌下，将常温蒸馏水（0.22 μm滤过灭菌）倾入该溶液乳化30 min，形成淡黄色、澄清透明的辣椒碱纳米乳。于洁净环境下，0.22 μm微孔滤膜过滤辣椒碱纳米乳，将续滤液灌装在已灭菌的2 mL、5 mL安瓿中，拉封。将灌封好的辣椒碱纳米乳注射剂121 ℃、0.1 MPa热压灭菌15 min，即得。

　　2.4    形态与粒径测定

　　2.4.1    形态测定    取适量辣椒碱纳米乳，滴在覆有支持膜的铜网上，静止10 min后用滤纸片吸干，滴加1～3％磷钨酸溶液于铜网上负染5 min，自然挥干，用透射电子显微镜观察并拍摄照片，结果见图1。结果表明:纳米乳剂中的乳滴呈类球形，粒径分布均匀。

　　图1    辣椒碱纳米乳透射电镜照片(×50 000)（略）

　　Figure 1    Transmission electron photograph of capsaicin nanoemulsion(×50 000)

　　2.4.2    粒径大小与分布测定    取辣椒碱纳米乳适量，采用动态光散射（dynamic light scattering,DLS）原理的Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，其粒径与粒度分布见图2。结果表明：辣椒碱纳米乳的平均粒径6.16 nm，多分散系数0.307，粒度分布均匀。

　　图2    辣椒碱纳米乳粒径分布图（略）

　　Figure 2    Particle size distribution of  capsaicin nanoemulsion

　　2.5    动电位测定
        
　　采用电泳光散射（electrophoretic light scattering,ELS）法，取辣椒碱纳米乳适量，室温下置Nicomp380/ZLS激光粒度/动电位分析仪测定，动电位分布见图3。结果表明，所得辣椒碱纳米乳电位(ζ)平均值为－34.0 mV。

　　2.6    pH值测定
      　　
　　测定3批辣椒碱纳米乳的pH值，每批测定3次，取平均值。3批乳剂的pH值分别为5.45、5.  43、5.45，符合静脉注射剂对pH值的要求。

　　图3    辣椒碱纳米乳动电位分布图

　　Figure 2    Zeta potential microscope distribution of capsaicin nanoemulsion

2.7    辣椒碱纳米乳含量测定

　　2.7.1    色谱条件与系统适应性试验    色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇?水?磷酸（体积比70∶30∶0.1）；荧光检测波长为λex=283 nm,λem=310 nm；流速为1.  0 mL·min-1；进样量为20 μL。辣椒碱保留时间12.3 min，理论塔板数4 156，拖尾因子1.13，峰形对称，色谱图见图4A。

　　2.7.2    样品溶液的制备    精密称取0.10 mg辣椒碱对照品，无水乙醇溶解并定容至10 mL，取该液1.  0 mL，无水乙醇稀释至10 mL，摇匀，制得1.0  μg/mL辣椒碱对照液。精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.  30 mL（约相当于辣椒碱12 μg），无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，制得1.2 μg/mL辣椒碱供试液。精密量取不含辣椒碱的空白纳米乳0.30 mL，同法制得阴性对照液。

　　2.7.3    方法专属性考察    分别量取对照液、供试液及阴性对照液20 μL，按上述色谱条件测定，结果表明，空白基质无干扰，且供试液与对照液保留时间基本一致，见图4。

　　图4    3种样品溶液荧光?HPLC图（略）

　　Figure 4    Fluorescence?HPLC of three samples

　　2.7.4    标准曲线绘制    精密称取辣椒碱对照品0.  20 mg于10 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得20 μg/mL辣椒碱标准储备液。精密吸取该储备液0.1、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0 mL置10 mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照液。分别进样20 μL，按上述色谱条件测定，以对照液质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，计算回归方程为：A=4×106ρ-224614，r=0.999 7，结果表明辣椒碱在0.20～6.00 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（S/N）＝3计算，测得辣椒碱最低检测限为0.1 ng。

　　2.7.5    精密度试验    取 0.1 μg/mL辣椒碱对照液，连续进样5次，测得平均峰面积为10 012 711，RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

　　2.7.6    重现性试验    按上述方法制备浓度为0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg/mL的辣椒碱供试液，各3份，以1.  0  μg/mL辣椒碱对照液的峰面积定量，结果各浓度辣椒碱含量平均值为91.10%、94.94%、91.  03%、91.01%、90.04%；RSD（n=3）为0.37%、0.85%、0.25%、0.42%、1.7%，表明本方法重现性良好。

　　2.7.7    稳定性试验    取供试液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h后按色谱条件测定，测得峰面积日内RSD为0.32%（n=7），表明供试液在24 h内稳定。每天测1次，连续测5 d，峰面积日间RSD为1.5%（n=5）。

　　2.7.8    回收率试验    精密量取0.50 mL空白纳米乳15份，分3组，置10 mL容量瓶中，分别加入20 μg/mL辣椒碱标准储备液0.40、0.50、1.00 mL，各5份，无水乙醇定容，超声混匀，0.45 μm滤过，精密吸取续滤液20 μL按上述色谱条件测定，外标法计算回收率。结果高、中、低浓度平均回收率分别为100.14%、102.56%、107.25%，RSD值分别为1.  30%、0.83%、0.58%（n＝5），见表7。

　　2.7.9    含量测定    精密量取0.004%辣椒碱纳米乳0.50 mL，无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，得辣椒碱供试液；另精密称取辣椒碱对照品适量，无水乙醇配成2.0 μg/mL辣椒碱对照液。分别吸取辣椒碱供试液、对照液20 μL，按上述色谱条件测定，外标法计算含量。结果3个批号辣椒碱含量分别为94.50%、94.55%和94.10%。

　　表7    辣椒碱纳米乳回收率（略）

　　Table 7    Recovery of capsaicin nanoemulsion

　　2.8    辣椒碱纳米乳包封率测定
      　　
　　包封率测定方法参照文献［13］:量取0.004%辣椒碱纳米乳0.3 mL滴到葡聚糖凝胶柱中心，2 000 r/min离心5 min，洗脱液用无水乙醇溶解并定容至10 mL，超声混匀，按“2.7.1”项色谱条件测定，将峰面积代入标准曲线计算药物浓度。根据式1-1计算辣椒碱纳米乳的包封率。
     
　　包封率＝（ρ包封/ρ总药）×100%             （1-1）
     
　　式中ρ总药表示辣椒碱总质量浓度，ρ包封表示纳米乳中被包封辣椒碱质量浓度。测得3批辣椒碱纳米乳的包封率分别为85.83%、84.50%、85.34%，RSD为0.79%。见表8。

　　表8    辣椒碱纳米乳包封率（略）

　　Table 8    Entrapment efficiency of capsaicin nanoemulsion

　　3    讨论

　　3.1    影响乳滴粒径因素

　　3.1.1    油、表面活性剂种类    油、表面活性剂种类是影响乳滴粒径的重要因素。根据纳米乳形成机理，当表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB）与油所需HLB值相当时，形成纳米乳较稳定［14］。当油、表面活性剂浓度不变，分别以大豆油、油酸乙酯、MCT为油相，形成乳滴粒径由小到大排列：吐温80＜泊洛沙姆F68＜豆磷脂。可见，乳化剂乳化能力由强到弱排列：吐温80＞泊洛沙姆F68＞豆磷脂。同时，表3结果也表明，乳滴粒径随吐温80增加、豆磷脂减少而逐渐减小，说明吐温80乳化能力较强。制备O/W型乳剂，所需乳化剂的HLB值在8～16范围内，吐温80的HLB值为15.0；而豆磷脂仅3.  0，脂溶性过强，在水相体系中分散性较差，难以在油水两相中很好的分配；相反，泊洛沙姆F68的HLB值为29.0［12］516-519，亲水性强，不能在油水界面大量吸附，也难以形成牢固的界面膜，故乳化能力均较差。
     
　　油的种类同样影响微乳的形成。如表1所示，吐温80作乳化剂，油酸乙酯或MCT为油相时均能形成透明微乳，而大豆油不能，这可能与大豆油为长链植物油，较难乳化有关。依据文献［15～18］报道，油相分子的大小以及碳链的长短影响微乳的形成：油相分子体积越小，对药物的溶解能力越强；碳氢链越短的油越能嵌入表面活性剂中形成界面膜，所得微乳相图区域越大。反之，碳氢链过长的油则不易形成微乳。因此，油酸乙酯、MCT较大豆油易乳化。

　　3.1.2    表面活性剂用量    当油、表面活性剂种类固定时，表面活性剂用量显著影响乳滴粒径的大小。如表2所示，吐温80∶MCT的质量比由1∶1增大到4∶1时，透光率由0.5%增大到99.6%，可见乳滴粒径随表面活性剂用量增大而减小。文献［19］也说明，纳米乳中乳化剂的用量为油量的20%～30%，而普通乳中乳化剂多低于油量的10%。这是因为纳米乳乳滴小界面积大，表面能高，需要浓度更高的乳化剂才能有效降低表面能，形成纳米乳。但考虑到毒性，在形成纳米乳前提下表面活性剂的用量应尽可能少。

　　3. 2    影响包封率因素
     
　　除了油的种类影响乳滴粒径以外，油的浓度是影响纳米乳包封率的关键因素。当MCT由0.15 g增大到1.50 g时，包封率由20.07%提高到85.  22%。这是因为当辣椒碱浓度不变时，增大油的量，乳化剂、助乳化剂按比例增加，药质比随之提高，使更多药物溶解在油、乳化剂、助乳化剂组成的均相中，形成均匀透明的溶液；遇水乳化后药物被包裹的比例随之提高。此外，表5、表6说明乳化温度与油、水滴加顺序对辣椒碱纳米乳包封率的影响不大。

【参考文献】
  　　［1］ 张志栋.辣椒碱的研究进展［J］.天津药学,1997，9（2）：16-17.

　　［2］ 吴明光.新型长效镇痛药辣椒碱研究进展［J］.中国新药杂志，1994，3（4）：367-369.

　　［3］ 郭峰，姜晓钟.辣椒素的作用机制及其镇痛应用［J］.第二军医大学学报, 2002，23(1)：25-28.

　　［4］ 马昭朝，王孝蓉，赵志刚.辣椒碱软膏［J］.中国新药杂志，2005，14（2）：123-125.

　　［5］ 龙晓英，罗佳波，严志红，等.局部用辣椒碱传递体的制备及体内外评价［J］.药学学报，2006，41(5)：461-466.

　　［6］ 郝保华，马玲.促透剂对辣椒碱巴布剂透皮吸收的影响［J］.中草药，2005，36（7）：473-475.

　　［7］ 于力，张钧寿，周建平.纳米乳的研究及其在制剂学领域的应用［J］.药学进展，2006，30（11）：491-493.　

　　［8］ 陆彬.纳米乳与亚微乳给药系统［J］.中国药师，2004，7（10）：489-490.

　　［9］ PARK KM， KIM CK. Preparation and evaluation of flurbiprofen?loaded microemulsin for parenteral delivery ［J］. Int J Pharm, 1999, 181(2)：173-179.

　　［10］ 阎家麒，王惠杰，童岩，等.紫杉醇微乳的研究［J］.中国药学杂志，2000, 35(3)：267-269.

　　［11］ SCHMIDT S，MUELLER R H.Plasma protein adsorption patterns on surfaces of amphotericin B?containing fat emulsions［J］.Int J Pharm，2003，254(1)：3.

　　［12］ 罗 R C，舍斯基 P J，韦勒 P J.药用辅料手册［M］.4版.郑俊民,译.北京：化学工业出版社，2005.

　　［13］ 洪彗，龙晓英，李力任，等.葡聚糖微型凝胶柱测定辣椒碱柔性脂质体包封率的条件探讨［J］.广东药学院学报，2005，21（2）：152-154.

　　［14］ 张正全，陆彬.微乳给药系统研究概况［J］.中国医药工业杂志，2001，32(3)：248-250.

　　［15］ 赵岚.微乳及其应用［J］.化学教育，2006（2）：147-149.

　　［16］ 周建平.药用微乳处方设计概述［J］.中国医药工业杂志，2006，37（8）：423-425.

　　［17］ WARISNOCI W, LANSLEY A B, LAWRENCE M J. Nonionic oil?in?water microemulsions:the effect of oil type pn phase behavior［J］.Int J Pharm,2000,198:727-725.

　　［18］ KAN P, CHEN Z B, LEE C J, et al. Development of nonionic surfactant/phospholipid o/w emulsion as a paclitaxel delivery system［J］. J Control Release,1999,58(3):271-278.

　　［19］ 崔福德.药剂学［M］.6版.北京：人民卫生出版社，2007：391-393.