野生型p53/junB融合基因真核表达载体的构建

由于恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的过程，同时不同的患者之间也具有较大的差异，因而导致单一的基因疗法往往效果不理想。最新的研究结果显示，肿瘤基因治疗最好的办法是寻找另一条涉及到多个基因的网络、可控制肿瘤的失控性生长和扩散的途径。野生型p53(wtp53)与核转录调节因子junB基因，均具有抑制肿瘤细胞生长、促进其凋亡的功效[1]。MARREIROS等[2]研究发现，wtp53与junB具有协同效应，共同担负着调节特异性肿瘤转移抑制基因—KAI1的转录活性。本研究基于以上的研究结果，通过基因重组技术设计并构建pEGFP-C1-wtp53/junB融合基因真核表达载体，期待该融合基因不但具有促进肿瘤细胞凋亡，同时通过调节KAI1基因表达来达到抑制恶性肿瘤转移、复发的功效；同时转染人肝癌细胞株HepG2，为进一步研究两者在肝癌中的协同作用奠定一定的基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  菌株、质粒与细胞株

　　大肠杆菌top10、增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1由本实验室保存；pDM19-T simple Vector购自TaKaRa；含junB基因mRNA序列全长cDNA基因的pOTB7质粒购自Proteintech Group, Inc.(Chicago, USA)；人肝癌细胞株HepG2由本室冻存。

　　1.1.2  主要试剂

　　高保真热启动Taq酶、1kb DNA Ladder Marker、内切酶BglⅡ、SalⅠ及BamHⅠ、T4 DNA Ligase购自TaKaRa；普通琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自Tiangen公司；Ampcilillin、Kanamycin购自Amresco；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂、细胞总RNA提取试剂(Trizol)购自Invitrogen 公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒：Fermentas。

　　1.1.3  主要仪器

　　高速低温离心机 581DR(EPPENDORF)，梯度PCR仪PTC-200(MJ Research Inc, USA)，凝胶成像系统BIO-RAD(Italy)。

　　1.1.4  引物设计

　　根据GenBank公布的p53(GeneID：7157)和junB(GeneID：3726)基因mRNA序列，分别长2640bp和1832bp，其中编码序列(CDS)分别长1182bp和1044bp，分别设计引物。

    p53：P1，5′-GAAGATCTGAGGAGCCGCAG-TCAGATCCTAG-3′；P2，5′-GCGTCGACGTCTG-AGTCAGGCCCTTCTG-3′。

　　JunB：P3，5′-GCGTCGACGGCTCCTCTACTTG-CACTAAAATGGAACAG-3′；P4，5′-CGGGATCC-TCAGAAGGCGTGTCCCTTGACCC-3′。

    结合载体情况，p53上游引物去除起始密码子并在5′端加上限制性内切酶BglⅡ，下游引物去除终止密码子并在5′端加限制性内切酶SalⅠ；junB上游引物去除起始密码子并在5′端加上限制性内切酶SalⅠ，下游引物不去除终止密码子并在5′端加BamHⅠ，其中下划线部分为内切酶的酶切位点，前面的是保护碱基，粗斜部分为linker序列，即Gly-Ser-Ser-Thr柔性连接肽序列。以上设计的引物在理论上表达的蛋白经同源性比对后完全正确。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  p53及junB基因的PCR扩增

　　以正常人外周血总RNA反转录得到的cDNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增p53基因(94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸5min)；以pOTB7-junB质粒为模板，P3、P4为引物进行PCR扩增junB基因(94℃预变性5min，94℃变性30s、67℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸5min)。电泳及凝胶回收目的片段。

　　1.2.2  构建pDM19-T-p53和pDM19-T-junB

　　p53基因及junB基因与T载体连接，转化感受态，挑选单克隆回收质粒，单、双酶切鉴定后送测序，将正确序列单克隆分别命名为pDM19-T-p53和pDM19-T-junB(图1)。

　　1.2.3  融合基因pEGFP-C1-p53/junB构建及鉴定

　　p53基因与pEGFP-C1载体连接：用BglⅡ及SalⅠ分别双酶切pMD19-T-p53及pEGFP-C1，回收约1.2kb的p53基因片段及4.7kb的pEGFP-C1片段进行连接，转化感受态，挑选单克隆，回收质粒并单酶切、双酶切及PCR鉴定，将其命名为pEGFP-C1-p53。pEGFP-C1-p53与junB基因连接：SalⅠ及BamHⅠ分别双酶切pDM19-T-junB及pEGFP-C1-p53，回收约1kb的junB基因片段及5.9kb的pEGFP-C1-p53片段进行连接，转化感受态，挑选单克隆，回收质粒并单、双酶切鉴定。最后送测序，将测序结果完全正确的单克隆命名为pEGFP-C1-p53/junB(图1)。

　　1.2.4  融合基因pEGFP-C1-p53/junB转染人肝癌细胞株HepG2

　　复苏冻存的HepG2细胞，用含80mL/L胎牛血清的1640培养液于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养。真核表达载体pEGFP-C1-p53/junB用脂质体法转染人肝癌细胞系SMMC-7721(按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书操作)。转染2d后更换为含1000μg/mL G418培养液，持续筛选1周后更换不含G418的培养液,继续培养和扩增得到稳定转染的细胞系；同法设立转染空质粒pEGFP-C1组为对照组。转染细胞置荧光显微镜下观察并照相。
　
　　2  结 果

　　2.1  wtp53及junB基因的PCR扩增

　　分别以正常人外周血总RNA反转录得到的cDNA及pOTB7-junB质粒为模板进行PCR扩增，得到约1.2kb的p53基因片段及约1kb的junB基因片段。电泳结果见图2。

　　2.2  质粒pDM19-T-wtp53和pDM19-T-junB的鉴定

　　pDM19-T-wtp53用BglⅡ单酶切得到约3.9kb的片段，BglⅡ和SalⅠ双酶切得到约2.7kb的载体片段和约1.2kb的p53基因片段；pDM19-T-junB用BamHⅠ单酶切得到约3.7kb的片段，SalⅠ和BamHⅠ双酶切得到约2.7kb的载体片段和约1kb的junB基因片段。电泳结果见图3。
　2.3  质粒pEGFP-C1-wtp53的鉴定

　　用BglⅡ单酶切得到约5.9kb的基因片段，BglⅡ及SalⅠ双酶切得到约4.7kb的载体pEGFP-C1片段及约1.2kb的p53基因片段(图4A)，以P1、P2为引物PCR扩增得到约1.2kb的wtp53片段(图4B)。

　　2.4  质粒pEGFP-C1-wtp53/junB的鉴定 教育核心期刊论文发表

　　用BamHⅠ单酶切得到约为6.9kb片段；BglⅡ及BamHⅠ双酶切得到大片段约4.7kb、小片段约2.2kb的单克隆(图5A)；SalⅠ及BamHⅠ双酶切得到大片段约5.9kb、小片段约1kb的单克隆(图5B)。

　　2.5  pEGFP-C1-wt p53/junB测序结果

　　测序结果与预期序列比较完全正确，部分序列见图6。

　　2.6  pEGFP-C1-p53/junB转染肝癌细胞株HepG2

　　空载质粒pEGFP-C1与pEGFP-C1-wtp53/junB分别转染人肝癌细胞株HepG2 细胞后48h，由于EGFP蛋白表达于细胞核与细胞质，因此荧光显微镜下可见空载质粒pEGFP-C1在细胞核及细胞质中均大量表达(图7A)；而pEGFP-C1-wtp53/junB转染细胞后，由于wtp53与junB均为核蛋白，其融合基因产物也应具有核定位的特性，因此仅有细胞核中有明亮的绿色荧光蛋白表达(图7B)，这显示了目的基因在细胞核中定位的特性。

　　3  讨 论

    恶性肿瘤的基因治疗方兴未艾，目前68%的基因治疗集中在肿瘤治疗方面，基因治疗之父FrenchAnderson博士断言：没有任何一项其他疗法能像基因治疗那样，为攻克困扰人类健康的重大疾病(如癌症)提供治愈的可能。但大量的基础研究与临床试验发现，单一的基因疗法并不尽人意，因此多基因联合、针对肿瘤的不同特征进行个体化治疗已成为基因治疗发展的一个趋势。永生化与侵袭转移是恶性肿瘤的两大特征，倘若可以通过联合基因治疗，达到抑制肿瘤生长、促使肿瘤细胞凋亡的同时抑制其转移，对于肿瘤的治疗将具有较为深远的意义。

　　3.1  构建p53/junB融合基因的意义 教育核心期刊论文发表

　　野生型p53(wtp53)，作为经典的凋亡促进基因备受关注，在>50%恶性肿瘤(包括肝细胞癌)中该基因常由于发生突变，导致正常功能丧失，从而丧失调节细胞正常增殖的功能，引发细胞失控性生长、永生化，进而恶化[3-4]，同时与肿瘤预后相关[5]。junB作为fos/jun家族成员之一，是AP 转录因子的主要成分，也是有丝分裂激活传递途径中的主要靶元件[6]。junB负调节细胞增殖及Ras介导的恶性转化[7]。研究表明[8]junB过表达的小鼠成纤维细胞由于G1期延长而提前衰老，细胞增殖数量减少，这主要是延迟细胞由G1期向S期进行；同时junB参与促细胞凋亡途径，junB失活的髓细胞凋亡降低，显示junB可以作为鼠髓细胞形成过程中潜在的抑癌基因。在肝癌的相关研究中也表明，junB表达的下调与肝癌发生有较为密切的关系[9-10]。MARREIROS[2]在实验中发现：特异性肿瘤转移抑制基因—KAI1启动子上游76bp区域包含wtp53、AP1、AP2的结合位点，通过DNA-binding技术，最终确认wtp53、AP1、AP2三者形成的复合物直接调控激活KAI1基因的转录。MARREIROS[11]进一步研究发现：AP1和wtp53在KAI1基因的转录中起着关键性的核心作用，并且二者之间具有协同效应；而AP1的组成部分之中，junB是唯一实现AP1对KAI1转录活性调节的成员，并且junB与wtp53具有协同效应，共同担负着调节KAI1转录的功能。

    由此可见，单独存在时，junB与wtp53仅仅作为肿瘤生长抑制因子发挥作用；当二者联合作用时，则在抑制肿瘤生长的同时具有了抑制肿瘤转移的协同功效。我们通过基因重组技术构建wtp53/junB融合基因真核表达载体pEGFP-C1-wtp53/junB，并成功转染人肝癌细胞株，为进一步研究二者的协同效应以及在肿瘤联合基因治疗中的应用奠定了基础。

　　3.2  pEGFP-C1-wtp53/junB融合基因载体构建策略

　　以往融合蛋白的获得通常通过功能区基因间直接连接、表达，两种功能区结构在蛋白折叠过程中往往互相影响，改变原有最佳空间结构域构象，使蛋白质功能活性大大降低。为了解决这种困惑，我们选用一种有一定空间伸缩性的人工中间接头：甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-苏氨酸(Gly-Ser-Ser-Thr)，及编码SalⅠ酶切位点的颉氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)共6个氨基酸组成的柔性肽(Val-Asp-Gly-Ser-Ser-Thr)连接序列，一方面将两翼结构域p53与junB撑开一定距离，便于各自正确折叠；另一方面又有一定柔性，可使两翼功能区同时与相应的配基结合，从而保持各自活性。本实验成功将p53与junB插入pEGFP-C1载体中，使他们处于正确开放阅读框下，为后续研究该融合基因功能奠定了基础。

    由于一般构建载体的方法是将目的基因PCR产物凝胶回收后进行双酶切，然后再次电泳凝胶回收后才与载体连接，这样使得带有黏性末端的目的基因片段回收效率大大降低，从而导致连接成功率也随之降低。本实验中我们选择了pMD19-T simple vector(大连宝生物公司)作为中间载体，该载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，其由pUC19载体改建而成，它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，再在pUC19载体的多克隆酶切位点处导入了EcoRV酶切位点，使用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3?端添加‘T’而成。与该公司的高保真、热启动Taq酶一起，不仅使得PCR变得高保真、高效、特异，而且PCR产物两端已经加上‘A’尾，因此回收后可直接与pMD19-T simple vector连接反应，然后转化感受态进行扩增，使后边的目的基因酶切以及连接到最终的真核表达载体变得容易。而且，我们在实验中并没有用到蓝白筛选就比较顺利地完成了整个实验过程。

    正确选择酶切位点关系到整个实验成功与否。除了要考虑到该限制性内切酶是否容易得到、价格、连接效率、星号活性存在与否教育核心期刊论文发表等等，更重要的是选择的酶切位点要使待构建的两目的基因处于正确的开放阅读框内，且目的基因序列内部不能含有要选用的酶切位点。本研究最开始选择的是XhoⅠ、SalⅠ、BamHⅠ三个酶切位点，后来发现XhoⅠ使得p53及junB基因的开放阅读框发生移码突变，而且XhoⅠ和SalⅠ属于同尾酶，那么在后边实验连接p53基因时会出现反向连接以及自身环化的问题，给实验增加难度，甚至可能失败。最后改为BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ三个酶切位点，使上述问题迎刃而解。

    本研究中pEGFP-C1-wtp53/junB融合基因真核表达载体的成功构建，为进一步研究二者的协同效应，以及在肿瘤联合基因治疗中的应用奠定了前期研究基础。