幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的病原体，也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关[1-4]。全世界范围内Hp的感染率超过50%[5]。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内还有多种抗氧化蛋白，其中烷基过氧化氢物还原酶(Ahp)最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族peroxiredoxins(prxs)的成员之一[6]。本研究利用基因克隆技术，将编码Hp ahpC外膜蛋白的基因经PCR扩增后，构建重组载体，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达和纯化，为进一步研究奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　幽门螺杆菌中国分离株MEL-Hp27(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-T Vector、Protein marker、T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  Hp基因组DNA的提取

　　刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取Hp DNA。

　　1.2.2  AhpC编码基因的扩增

　　根据GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下划线为NdeⅠ酶切位点；P2的序列为：5′-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点。

    以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

　　1.2.3  重组载体的构建

　　回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pMD18-T载体1μL、PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经蓝白斑筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22℃进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET30a-ahpC再经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.4  重组质粒的转化

　　将重组载体pET30a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养12～16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。抽提质粒，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任公司完成。

　　1.2.5  重组载体在E.coli中的表达

　　取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至A600达到0.5时，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG诱导，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照，采用SDS-PAGE电泳分析重组AhpC的表达。优化诱导表达条件,用UVP凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。
1.2.6  表达纯化rAhpC蛋白

　　将大量诱导的细菌4℃ 4000g离心收集细菌，PBS洗菌1次，重悬于纯水中，-20℃过夜后超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化效果。

　　2  结 果

　　2.1  Hp ahpC编码基因的扩增

　　以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，在600bp附近有单一条带，片段的大小与预计相符(图1)。

　　2.2  重组载体的酶切鉴定 科技论文发表网站

　　回收幽门螺杆菌ahpC基因的PCR产物，与pMD18-T连接后转化感受态DH5α受体菌，经蓝白斑筛选试验挑取白色菌斑扩增培养后，提取pMD18T-ahpC质粒。经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切切出约600bp片段，回收后与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pET-30a连接，获得阳性重组质粒，命名为pET30a-ahpC。重组质粒双酶切鉴定得到1条约594bp的带，与实验设计相一致(图2)，第3泳道出现第3条带，可能是因为双酶切时间为10h，酶切时间过长产生的非特异条带，但对实验结果无影响。

　　2.3  ahpC基因序列的分析

　　ahpC基因的测序结果见图3。ahpC的碱基测序结果与GenBank已公布的Hp菌株编码ahpC基因的序列进行同源性比对,其一致性达99%(590/594),其编码的氨基酸序列同源性为99%(197/198)。
　
　　2.4  重组载体在E.coli中的表达及表达形式鉴定

　　重组质粒pET30a-ahpC转化至E.coli BL21(DE3)中获得重组工程菌，接种LB液体培养基，于37℃培养至A600达到0.5时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导4h，收集菌体进行SDS-PAGE检测。可见在Mr 23ku处出现1条新的蛋白带，与理论预测值相符(图4)。

　　2.5  重组表达蛋白rAhpC的纯化

　　可溶性分析目的蛋白主要以可溶性方式存在。选取镍离子亲和层析柱纯化蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测洗脱液目的蛋白的分子大小。经UVP凝胶成像系统分析，洗脱所得目的蛋白的分子质量为23ku(图5)。

　　3  讨    论科技论文发表网站

    大多数细胞都具有产生和清除活性氧(ROS)的能力。在正常情况下，活性氧是作为分子氧单电子还原反应的不可避免的产物。正常细胞具有相关的保护机制维持细胞内最低水平的活性氧浓度。而过氧化氢是一种稳定的活性氧分子，能够穿过细胞膜并且在多种细胞的生理过程中起着重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表达、转录因子的活化、DNA合成和细胞分裂等过程。高浓度过氧化氢对细胞具有毒性，尤其是能够对细胞组分造成损伤；而适当浓度的过氧化氢可以作为第2信使分子参与信号传导途径并调节细胞代谢。而黄单胞菌中，Ahp和CAT(过氧化氢酶)等共同调控细胞内过氧化氢的水平，ahpC突变能引起细胞内过氧化氢水平下降[7]。黄志刚等[5]利用同源重组技术构建了Hp27基因敲除突变株(Hp27△cagA)，并利用蛋白质组学技术进行差异蛋白质的研究，发现Ahp在cagA基因敲除突变株菌体蛋白中表达下降，可能影响Hp的抗氧化应急能力。本研究对编码Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因进行克隆，并进行序列测定，所得序列与GenBank公布的序列一致性为99%；成功构建重组表达载体pET30a-ahpC，经过双酶切及测序鉴定，结果与预测一致；经42℃转化入感受态细胞BL21中；重组工程菌在37℃使用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约为23000的目的蛋白；经超声破菌和电泳分析，重组表达蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。经镍离子亲和柱层析纯化得到烷基过氧化氢还原酶的重组蛋白。本研究为进一步研究烷基过氧化氢还原酶的作用机制奠定了基础。