大鼠肾间质纤维化过程中血流变学改变与氧化应激

 肾间质纤维化是各种终末期肾脏疾病的主要病理过程，目前其发病机制尚未完全阐明。现有研究证明，氧化应激损伤在肾间质纤维化发病过程中起重要作用，抗氧化能有效延缓肾纤维化进程[1]。本实验采用经典的单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）致大鼠肾间质纤维化模型，动态观察大鼠血液粘度改变、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的改变，以及对肾间质α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，探讨血液流变学改变情况和肾脏氧化应激反应对大鼠肾间质纤维化形成的影响。 工程论文发表
材料和方法
    1 材料
    试剂和仪器
    丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；全自动血流变快测仪(FASCO-3010，重庆大学维多生物工程研究部)；AX70荧光显微镜（Olympus）；722型分光光度计（厦门分析仪器厂）。 工程论文发表
    2 方法
    2.1 动物模型的建立及分组 
    雄性SD大鼠36只，体重200g左右 ,清洁级动物，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供。动物随机分为2组：假手术组18只，单侧输尿管梗阻手术（模型组/UUO组）18只。大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(3 ml／kg)麻醉，常规消毒，沿腹白线开腹，暴露并分离左侧输尿管，模型组在左输尿管中、上l／3处两次结扎，连续缝合关闭腹腔，间断缝合皮肤。术后连续5天腹腔注射青霉素4u/天/只，假手术组不结扎输尿管，其余操作过程均相同。
    2.2 指标检测 
    两组分别于术后7天、14天、21天麻醉（同前）6只动物，腹主动脉取血5ml抗凝，37℃恒温保持，4小时内检测全血高、中、低切粘度，血浆粘度和全血还原粘度。处死动物，立即取左侧肾脏，对剖取一半用10%中性甲醛固定，72小时后石蜡包埋切片，HE染色和α-SMA免疫组化染色；另一半-20℃冻存，按试剂盒说明，羟胺法测SOD，硫代巴比妥酸法测MDA。
    2.3 数据分析
    数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析,结果以均数±标准差（x-±S）表示，组间比较采用单因素方差分析，全血还原粘度与肾组织T-SOD、MDA关系采用Pearson相关分析。
结果
    1 肾脏形态
    假手术组大鼠双侧肾脏颜色红润，中等大小，包膜完整压力不高；模型组大鼠梗阻侧肾（左肾）体积随梗阻时间的延迟而逐渐增大，呈囊状，压力高，包膜不光滑，外有脂肪组织包裹，皮质较薄，色暗红；右肾无明显差异。
假手术组各时点的肾组织HE染色未见异常。模型组7天，肾小管扩张明显，部分近端小管变性坏死，管腔内可见脱落的上皮细胞，肾间质内大量炎细胞浸润。模型组14天，部分肾小管扩张，部分萎缩，肾间质内炎细胞浸润更明显，纤维细胞增殖明显。模型组21天，肾小管萎缩明显，部分已经消失，纤维细胞增殖更多，肾间质内见明显纤维化。α-SMA免疫组化染色显示各时点假手术组无明显差异，模型组随梗阻时间增加，肾间质胶原纤维沉积越多。
    2 血液流变学指标比较
    模型组较假手术组全血粘度、血浆粘度及全血还原粘度均增高（*：P<0.05，#：P<0.01）。见表1。
    Tab 1a  The chang of property of hemorheology in each group at 7d(x-±S,n=6）
Group Hηb(mpPa.s) Mηb(mpPa.s)Lηb(mpPa.s)ηp(mpPa.s)ηre(mpPa.s)
Sham5.10±0.327.05±0.2815.06±1.561.34±0.129.42±0.47
UUO6.63±0.49*8.31±0.60* 17.34±0.98*1.56±0.19*11.63±0.63#
    Tab 1b  The chang of property of hemorheology in each group at 14d(x-±S,n=6）
Group Hηb(mpPa.s) Mηb(mpPa.s)Lηb(mpPa.s)ηp(mpPa.s)ηre(mpPa.s)
Sham5.21±0.477.23±0.3015.02±1.281.42±0.0810.06±0.53
UUO7.34±1.35#9.14±1.63#18.46±2.52#1.68±0.15#13.08±0.81#
    Tab 1c  The chang of property of hemorheology in each group at 21d(x-±S,n=6）
Group Hηb(mpPa.s) Mηb(mpPa.s)Lηb(mpPa.s)ηp(mpPa.s)ηre(mpPa.s)
Sham5.17±0.487.30±0.4715.13±1.371.38±0.1110.20±0.37
UUO6.75±0.84*8.46±0.62*17.60±1.67#1.53±0.06*11.73±0.91*
与假手术组比较*：P<0.05，#：P<0.01。  3 肾组织T-SOD和MDA比较
    模型组肾组织T-SOD活性较假手术组显著降低，MDA水平显著升高（P<0.01）。见表2。工程论文发表
Tab 2a  T-SOD activiyty of each group (x-±S,n=6）U/mgprot
timeShamUUO+NS
7d146±14.50102±23.21#
14d150±20.1386±15.24#
21d147±18.3479±21.05#
Tab 2b  MDA levels of each group (x-±S,n=6）nmol/mgprot
timeShamUUO+NS
7d5.26±0.2812.12±3.45#
14d4.98±0.2420.41±2.56#
21d4.75±0.5718.24±1.29#
与假手术组比较#：P<0.01。
    4 相关性分析
    Pearson相关分析表明肾组织中MDA含量与全血还原粘度成正相关（P<0.01），肾组织T-SOD活性与全血还原粘度成负相关（P<0.01）。
    讨论
    肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞是肾间质纤维化发病的重要机制之一,肾小管上皮细胞转分化过程中α-SMA表达阳性的成纤维细胞是致间质纤维化的主要细胞[2]。单侧输尿管梗阻致肾间质纤维化是研究肾间质纤维化的经典模型[3]。本实验结果显示，在单侧输尿管梗阻过程中，肾小管上皮细胞损伤逐渐加重，随梗阻时间增加，部分肾小管上皮细胞被成纤维细胞代替，α-SMA的表达增加，间质纤维化程度加重。肾组织抗自由基作用的酶SOD含量减少，脂质过氧化产物MDA含量增加，这与文献报道一致[4,5,6]。输尿管梗阻后，尿液逐渐积聚，压迫肾组织，肾脏持续缺血缺氧，导致肾清除氧自由基的能力降低，组织的脂质过氧化反应增加，介导了肾毒性损伤，促使α-SMA的表达增加，肾实质细胞转分化为纤维母细胞，并增殖分化，使细胞外基质沉积增加，间质纤维化程度逐渐加重。
    血液粘度是衡量血液流变性的常用指标，是决定血流阻力的重要因素。当血液中有超生理浓度的自由基时，膜脂发生过氧化反应及膜蛋白交联，会直接减低膜磷脂含量及膜的流动性，使红细胞刚性化，变形性下降，全血粘度和血浆粘度均增高。本研究结果表明，随着单侧输尿管梗阻时间增加，肾组织MDA含量增加，SOD活性下降，血液粘度增加，病理切片显示，肾间质α-SMA表达增加，间质纤维化程度加重。肾脏是高耗氧器官，持续梗阻压迫，肾组织缺血缺氧严重，氧化应激反应明显增加，大量脂质过氧化产物生成，导致血粘度增加，进一步加重肾组织缺氧，形成恶性循环，肾纤维化加重。减少机体氧化应激反应，降低血粘度，可有望减缓肾纤维化进程，还有待深入研究。  工程论文发表
参 考 文 献
[1] Xie XS，Liu HC．Ginsenoside Rb1, a panoxadiol saponin against oxidative damage and renal interstitial fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction [J] .Chin J Integr Med 2009 15(2):133-140.
[2] Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis [J] . J Am Soc Nephrol. 2010 Feb;21(2):212-222.
[3] 徐志宏, 谌贻璞 .肾间质纤维化动物模型的制作和研究进展[J].基础医学与临床,2006,26(11):1281-1285.
[4] SUNAMI R ,SUGIYAMA H,WANG DH,et a1.Actalasemia sensitizes renal tubular epithelial cell to apptosis and exacerbates renal fibrosis after unilateral ureteral obstruction[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,286:1030-1038.
[5] Watanabe S,Tima Y,Yamaguchi T,et al. Potassium bromate induced hyperuricemia stimulates acute kidney damage and OX-idative stress.[J].Journal of Health Science,2004,50(6):647-653.
[6] 张晓萱,李银辉,郑伟,等,单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中氧应激的变化.[J].中国现代医学杂志,2007,17(4):414-417.