HPLC法测定恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量

恒古骨伤愈片是由中成药恒古骨伤愈合剂(收载于《国家中成药标准汇编 骨伤科分册》)改变剂型而制成的新制剂[1],药味由陈皮、红花、三七等9味中药组成,具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的功效, 用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症等。为控制本品的质量,本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定了恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量,作为其内在质量控制指标之一。

　　1  仪器与试药

　　日本岛津LC-10 AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ-250型超声波处理器。建筑论文发表

　　橙皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号1107221-200211,HPLC面积归一化法,测定含量为99.99%)；恒古骨伤愈片由吉林万德制药有限公司提供(批号20080401, 20080402,20080403,20080501,20080502,20080503,20080504, 20080505,20080506,2008057)。其他所用化学试剂均为国产AR级。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

    色谱柱：Shim-pack-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：283 nm；理论塔板数按大黄素计算不低于5 000；柱温为室温[2]。

　　2.2  对照品溶液的制备

    精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL约含0.05 mg的溶液,即对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备

    取本品20片,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声提取(功率180 W、频率60 kHz)30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。

　　2.4  阴性对照溶液的制备

　　按处方量制备不含陈皮药材的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定。结果表明,阴性对照溶液色谱图中与对照品相应位置处无干扰,此法可行(见图1)。建筑论文发表

　　2.5  线性关系考察
  
　　精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.048 5 mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,测定其峰面积。以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归,得到回归方程为：Y＝1 008 770.377X＋25 623.859,r＝0.999 9,结果表明,橙皮苷在0.194～0.970 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.6  精密度试验

    精密吸取供试品溶液连续5次重复进样,测得橙皮苷峰面积RSD＝0.57%。

　　2.7  稳定性试验

    精密吸取供试品溶液在0、2、4、6 h分别进样,进行测定。结果橙皮苷峰面积RSD＝0.47%,表明在6 h内供试品溶液中橙皮苷含量稳定。

　　2.8  重复性试验

    精密称取同一批号样品5份,按供试品溶液的制备方法制备,依法进样分析,结果样品中橙皮苷含量RSD＝0.50%,表明其重复性良好。

　　2.9  加样回收率试验

    精密称取橙皮苷对照品适量,加入到已测知橙皮苷含量的恒古骨伤愈片样品(批号20080401,橙皮苷含量3.081 5 mg/g)中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,制得供试品溶液,进样5 μL,测定并计算回收率。结果平均回收率为98.5%,RSD＝0.63%。见表1。表1  加样回收率试验结果（略）

　　2.10  样品测定

　　按上述方法,制备供试品溶液,测定10批恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量。测定结果表明,恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量基本稳定,暂定为每片含橙偿皮苷含量不得少于1.40 mg。结果见表2。表2  恒古骨伤愈片中橙皮苷含量测定结果（略）

　　3  讨论
   
　　有关橙皮苷的HPLC含量测定方法较多,流动相采用乙腈、甲醇、水、冰醋酸等系统[3-4]。我们通过摸索,采用乙腈、磷酸水系统,色谱分离效果较为满意,分离度及峰形对称性较好。

    待测成分橙皮苷易溶于甲醇,故采用甲醇溶剂提取。对供试品提取方法的考察采用加热回流提取和超声提取,测定结果分别为3.812、3.810 mg/g,两种方法制得的供试品中橙皮苷含量无差异,均可使橙皮苷提取完全。为了简化操作,故选用超声提取制备供试品溶液。本试验对超声提取时间进行了考察,分别以20、30、40 min进行超声提取,测定结果分别为3.652、3.811、3.813 mg/g,超声提取30 min以上,可使橙皮苷充分浸出,为了缩短检测时间,故确定超声提取时间为30 min。