亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析

鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。

　　1.1.2主要试剂和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。

　　1.2方法

　　1.2.1Annexins B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫Annexins B2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。论文发表网

　　1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定，并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。

　　1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的Ni-IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。

　　1.2.4Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Western blotting鉴定。
2结果

　　2.1Annexins B2基因的识别和序列分析该基因全长922bp，编码区为224～686bp。其最大ORF为其完整编码区。

　　2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行0.8g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符。此外，重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图1)。

　　2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/L。

　　2.3Western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性

　　用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带，而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3)，表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的PCR和双酶切鉴定　　Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA标准(DL2000);1：PCR产物;2：pET-28a(+)质粒双酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重组质粒双酶切;M2：DNA标准(DL 15000)。图2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product　　M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未诱导;2：pET-28a(+)IPTG诱导;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未诱导;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG诱导;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2纯化蛋白。论文发表网

　　3讨论

　　带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的Western blotting 鉴定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。

　　本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。

　　膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有EF手，而且在和Ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶A2的活性及细胞内外Ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。

　　目前，Annexins B2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。