CD83、CD1a标记肿瘤浸润性树突状细胞在大肠癌中的表达及其预后意义

　树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前所知机体内功能最强的抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者.肿瘤组织内浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)的数量与功能对机体免疫有重要提示意义，与肿瘤的临床分期和预后相关[1]。TIDC被认为是机体对肿瘤的一种局部免疫反应。CD83和CD1a是鉴定人外周血中DC的最好标志。本研究采用免疫组化和流式细胞术分别检测大肠癌组织中CD83和CD1a的表达情况，分析二者与大肠癌临床病理特点和预后的关系，进而了解肿瘤组织局部免疫状况对预后的影响。工程论文发表

　　1材料与方法

　　1.1标本来源收集遵义医学院附属医院普外科自1990年6月至2006年6月经病理确诊的60例大肠癌石蜡标本，均为原发病灶(临床资料完整)，男41例，女29例，年龄26～78(中位数52)岁;高分化30例，中分化9例，低分化21例;Dukes分期：A期6例，B期25例，C期21例，D期8例;伴有淋巴结转移14例，无淋巴结转移46例;≥5年生存者30例，<3年死亡者30例。所有患者均为第一次手术，术前未经任何放化疗，随访至术后5年以上(随访资料完整)。

　　1.2主要试剂CD83单克隆抗体(HB15a：sc-19677)、CD1a单克隆抗体(GM357101/02/04)、Envision试剂盒(二抗、三抗试剂)均购于上海基因科技有限公司。流式细胞仪(FACS Calibur，Becton Dickinson, USA)，PE标记的抗CD83抗体、APC标记的抗CD1a抗体，均为美国BD公司产品。

　　1.3免疫组化染色采用SABC法检测操作流程，具体操作步骤按照说明书进行。以试剂公司提供的阳性切片为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。判定结果：CD83、CD1a均定位于胞膜或胞浆。以细胞膜、细胞浆或细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。光镜下切片按统一放大倍数(×400)，选肿瘤区阳性表达最强的5个高倍视野，数码拍照，输入图像分析软件Image-Pro Plus 6.0中，准确分割出阳性区域，测量单位光学密度值(Mean Density)。相同条件下，每个图片测量3次，以所得3个光密度值的均数作为该图片视野中CD83、CD1a的表达强度。以同一切片的5个视野各自测得的平均光密度值的均数作为该切片所代表的单样本的CD83、CD1a的表达强度。

　　1.4流式细胞术测定取10g标本，经脱蜡、水化、胰蛋白酶工程论文发表37℃恒温水浴震动消化30min，300目尼龙网过滤，生理盐水10min离心2次(500～800r/min)，去除细胞碎片。沉淀细胞PBS重悬并计数，取106个细胞，加入流式细胞检测管，离心弃上清，分别加入抗CD83-PE抗体、抗CD1a-APC抗体，混匀后室温避光孵育30min，1mL PBS稀释，离心弃上清，加固定液150μL上机检测。

　　1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。计量资料的均数比较采用独立样本的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1大肠癌组织中TIDC的CD83和CD1a表达60例大肠癌组织进行免疫组化检测，CD83阳性表达19例。各标本间阳性细胞分布不一，肿瘤细胞间(图1A)或肿瘤边缘正常组织(图1B)中均有散在分布，胞体较大，圆形。CD1a阳性表达24例。胞体较大，圆形，阳性细胞散在分布于癌巢内(图1C)、肿瘤周边及正常组织之间(图1D)，以癌巢组织区域分布较多。60例大肠癌组织经流式细胞仪均检测到CD83和CD1a表达(图2A、图2B)。CD83表达范围在0.06%～3.98%。CD1a表达范围在0.33%～9.45%。图1CD83及CD1a在大肠癌组织及边缘组织中的表达　　Fig.1 CD83 and CD1a expressed in colorectal cancer tissues and the edge(DAB, ×200)A：大肠癌组织CD83表达;B：大肠癌组织边缘CD83表达：C大肠癌组织CD1a表达：D大肠癌组织边缘CD1a表达。图2CD83及CD1a在≥5年生存组及<3年死亡组大肠癌组织中的表达Fig.2 CD83 and CD1a expressed in colorectal cancer tissues of ≥5-year survival group and<3-year death groupA：≥5年生存组大肠癌组织CD83、CD1a表达;B：<3年死亡组大肠癌组织CD83、CD1a表达。

　　2.2大肠癌组织中TIDC的CD83和CD1a表达与临床的关系CD83和CD1a的表达与大肠癌患者分化程度、淋巴结转移无明显关系，与Dukes分期、预后相关。免疫组化检测显示(表1)，CD83和CD1a在A期+B期大肠癌中表达均高于C期+D期组，差异有统计学意义(P<0.05);≥5年生存组表达高于≤3年死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测显示，CD83在A期+B期大肠癌组织中的表达高于C期+D期组(t=2.916，P<0.05);CD1a在A期+B期大肠癌组织中的表达高于C期+D期组(t=2.747，P<0.05)，CD1a在≥5年生存组表达高于≤3年死亡组(t=3.713，P<0.05)。表1免疫组化测试CD83、CD1a表达与大肠癌临床病理的关系
　3讨论

　　肿瘤抗原是诱导细胞免疫反应的一个关键性调控步骤，DC是目前所知机体内功能最强的抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者。其提呈抗原的能力比腹腔巨噬细胞和B细胞至少强10倍。DC在大肠癌发生、发展中有重要作用，其浸润密度在一定程度上反映了机体抗肿瘤免疫强度[2]。研究表明同源结肠癌患者外周血DC和T淋巴细胞共孵后能增加T淋巴细胞的活性[3]，并且可以抑制裸鼠体内移植瘤的生长[4]。CD83是人成熟DC的主要特征性标志，其激活淋巴细胞功能最强[5]，由于成熟DC的低水平表达，不能使肿瘤抗原引起有效免疫应答，从而诱导了T细胞的无能状态，使得机体的免疫系统不能将肿瘤细胞清除，是肿瘤无限制性生长的原因之一[6]。研究显示大肠癌中CD83表达与患者临床分期和预后显著相关[7]。CD1a是一种提呈脂类抗原的分子，已广泛应用于DC分离、纯化和体外培养的鉴定。结直肠癌中具有CD1a标记的TIDC浸润程度与患者生存期相关[8]。研究显示体外诱导、培养人外周血单核细胞获得的未成熟DCs中度表达CD1a，在DCs的成熟期CD83分子有高水平表达[9]。因此，通过对CD83、CD1a的检验分析，可评价TIDC在大肠癌病灶中的浸润密度和功能状况，进而了解患者机体免疫状况及其对预后的影响。

　　本研究发现，大肠癌组织中CD83和CD1a标记的TIDC与Dukes分期密切相关，Dukes分期早的肿瘤组织中浸润程度高，易激活机体产生有效地抗肿瘤免疫，预后较好。≥5年生存组的大肠癌组织中CD83和CD1a表达较<3年死亡组的大肠癌组织中CD83和CD1a表达高，二者表达高的大肠癌患者预后好，与文献一致。提示CD83和CD1a标记的TIDC可以作为判断大肠癌预后的参考指标使用。但FCM结果显示，大肠癌组织CD83有低水平表达，且≥5年生存组和<3年死亡组间表达无统计学差异。这可能是由于大肠癌组织中成熟DC较少和/或本研究的样本例数少有关，有待进一步研究。

　　目前利用CD1a标记TIDC存在缺陷，CD1a只能代表TIDC其中的一个亚型，本研究分别检测TIDC的标记物CD1a和CD83并不能反映局部癌组织中的全部TIDC。下一步在研究大肠癌组织中TIDC浸润数量与预后的关系时，应进一步寻找TIDC的特征性标志，增加TIDC计数的准确性，对大肠癌患者的预后能做出更好的判断。