正常和6?羟多巴胺毁损大鼠脚桥核神经元对胆碱能M受体刺激的反应

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脚桥核(pedunculopontine nucleus, PPN)是一中脑的神经结构，由胆碱能和非胆碱能神经元组成[1]。解剖学和电生理学研究表明PPN与基底神经节有丰富的交互纤维联系，在运动调控中起重要作用[1]。PPN的主要传入纤维包括来自黑质网状部(substantia nigra pars reticulate, SNr)和脚内核(endopeduncular nucleus, EP)的γ?氨基丁酸能神经纤维，以及来自底丘脑核(subthalamic nucleus, STN)和额叶皮质的谷氨酸能神经纤维[1?2]。PPN的上行传出纤维主要投射到黑质致密部(substantia nigra pars compact, SNc)、STN、EP、苍白球、纹状体和丘脑;下行传出纤维主要投射到延髓[1?2]。

　　研究表明在帕金森病(Parkinson?s disease, PD)动物模型中PPN神经元的电活动显著增强[3]。最近研究发现在6?羟基多巴胺(6?hydroxydopamine, 6?OHDA)毁损的PD模型大鼠中，PPN内细胞色素氧化酶mRNA的表达量增加[4]。这些研究结果提示了黑质纹状通路损毁后PPN处于过度活动状态。另外，原位杂交研究显示PPN神经元上有胆碱能M2、M3和M4受体亚型的表达，且M2受体表达的密度最高[5]。然而，在正常和PD状态下PPN内M受体的功能尚不清楚。因此，本研究采用玻璃微电极细胞外记录法，观察了PD模型大鼠PPN神经元电活动的变化，以及PPN内微量注射选择性胆碱能M受体激动剂氧化震颤素(oxotremorine M, Oxo?M)对正常和PD模型大鼠PPN神经元活动的影响，旨在探讨M受体在正常和PD状态下在PPN 神经元活动中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和药物 实验选用成年、雄性SD大鼠，体重220～260g，由西安交通大学实验动物中心提供。动物分笼饲养，每笼5只，自由摄食饮水，24h昼夜循环光照。实验所用药物地昔帕明、6?OHDA、Oxo?M和盐酸阿朴吗啡均购自美国Sigma公司。地昔帕明、阿朴吗啡和Oxo?M均溶于无菌生理盐水;6?OHDA溶于含0.1g/L抗坏血酸的生理盐水中。

　　1.2 PD模型的制备 在注射6?OHDA前30min，先给大鼠注射地西帕明(25mg/kg，i.p.)以保护去甲肾上腺素能神经元。大鼠用40g/L水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉后将其头部固定于脑立体定位仪上(SN?2N，Narishige，日本)，根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧SNc的坐标位置：前囟后4.9～5.3mm，矢状缝右侧1.8～2.2mm，硬脑膜下7.2～7.4mm[6]。微量注射使用尖端与玻璃微电极相连的10μL微量注射器，分两点在SNc内注射6?OHDA，每个注射位点给予2μL 6?OHDA溶液(2g/L)，总量2g/L。注射完后留针5min，然后缓慢退出玻璃微电极。术后两周进行阿朴吗啡诱导的旋转实验，给大鼠注射阿朴吗啡(0.05mg/kg，s.c.)，大鼠在5min内向损毁侧的对侧旋转超过20圈，表明造模成功[3,7]。

　　1.3 电生理记录及放电形式分析 电生理记录在SNc损毁后第3周进行，整个实验过程监测大鼠心率，肛温维持在(37±0.5)℃。大鼠用200g/L乌拉坦麻醉(1.2g/kg，i.p.)后固定于脑立体定位仪上，采用在体玻璃微电极细胞外记录法记录PPN神经元放电，电极尖端直径1～2μm，阻抗10～20MΩ，充灌液为0.5mol/L的醋酸钠，含20g/L滂胺天蓝。根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧PPN的位置：前囟后7.3～8.3mm，矢状缝右侧1.6～2.0mm，硬脑膜下6.2～7.2mm[6]。神经元放电经微电极放大器(MEZ?8201, Nihon Kohden，日本)，显示于记忆示波器上(VC?11, Nihon Kohden，日本)，神经电信号经CED1401 Spike2(Cambridge Electronic Design，英国)采集和分析。

　　根据放电间隔直方图(interspike interval histogram, ISIH)，并结合原始放电序列，将神经元的放电形式分为以下3种类型：①规则放电：ISIH呈对称分布;②不规则放电：ISIH呈随机不对称分布;③爆发式放电：ISIH呈逐渐衰减的正偏态分布。每一个ISIH的生成最少包含500个连续的动作电位，bin宽4ms。另外，根据ISIH计算出平均放电间隔的变异系数。变异系数是放电间隔的标准差与平均放电间隔之比，反映神经元电活动的规则程度[3,7]。

　　1.4 局部给药 PPN内微量注射使用与1μL微量注射器相连接的玻璃微电极，微电极尖端直径约50μm。将给药微电极和记录微电极固定于微电极操纵器上，调整两个电极使其尖端的位置非常接近(小于0.4mm)。核团内微量注射药物或盐水的剂量均为200nL，约3min注完。一般情况下，微量注射的机械作用会引起神经元的放电幅度降低，这种作用约持续1min。因此，在统计数据时，微量注射后1min内的放电活动不予计算。每个神经元在给药前记录5min自发放电作为前对照，给药1min后记录5～10min以观察给药后神经元电活动的变化。与前对照相比，放电频率的改变超过20%则认为有显著性变化。每只大鼠只观察1个神经元对药物的反应。

　　1.5 组织学及免疫细胞化学 电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝(-20μA，15min)标记最后一个记录位点。大鼠在过量麻醉后，经心脏灌注生理盐水，随后用40g/L多聚甲醛灌注固定;取脑后固定4h;再将鼠脑置于含200g/L蔗糖的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中过夜;连续冠状冰冻切片，片厚40μm，行尼氏染色以确定记录神经元的位置。

　　为确认多巴胺能神经元的损毁程度，将大鼠SNc的脑片行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)染色[7]。先将脑片在室温条件下置于含3g/L TritonX?100中30min;然后置于含30g/L牛血清蛋白的PBS中室温30min;接着加入一抗(1∶800，Chemicon，美国)，在4℃条件下孵育48h;加入生物素标记的二抗(1∶200，Chemicon，美国)室温孵育2h;再加入抗生物素蛋白?生物素过氧化物酶复合物(1∶100，Vector，美国)室温孵育2h;

　　最后将脑片置于含0.1mL/L H2O2的0.5g/L DAB显色剂中室温下显色5～10min。除加入一抗外，其他步骤之间均需漂洗。最后，将脑片裱于明胶处理过的载玻片上，待自然干燥后，常规酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜下行TH阳性细胞计数。在6?OHDA毁损组，只有注射侧SNc内TH阳性神经元完全或几乎完全缺失的大鼠进行电生理资料统计。

　　1.6 数据统计与分析 两组间或组内放电频率的比较采用Student?s t检验，PPN神经元对Oxo?M不同反应的百分比及神经元放电形式的比较采用χ2检验。平均放电间隔和变异系数的比较采用Mann?Witney U检验。所有数据均以

　　±s或对照的百分比表示。定义P<0.05为显著性差异的标准。

　　2 结 果

　　尼氏染色结果证实，所有正常和6?OHDA毁损组大鼠通过滂胺天蓝电泳标记的记录位点均位于PPN内(图1A)。本研究中的6?OHDA毁损组大鼠在阿朴吗啡诱导旋转实验中均表现出恒定的向损毁侧的对侧旋转，且5min内旋转圈数均超过20圈[34±3(圈/5min)]，这些大鼠在TH染色后毁损侧SNc内多巴胺能神经元均完全消失(图1B)。

　　2.1 正常组和6?OHDA毁损组大鼠PPN神经元的电活动 在正常组的28只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.0～19.3spikes/s，平均为(8.1±1.1)spikes/s(n=28，图2A)。平均放电间隔为(263±71)ms，平均变异系数为0.37±0.05(图2B、2C)，大多数PPN神经元(61%)呈现出规则放电，32%的神经元为不规则放电，7%的神经元为爆发式放电(图2D)。在6?OHDA损毁组的33只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.2～49.7spikes/s，平均放电频率为(13.1±2.2)spikes/s，与正常组相比明显增加(n=33，P<0.01;图2A)。平均放电间隔

　　图1 6?OHDA损毁大鼠脚桥核内标记的记录位点和TH免疫组化染色显示6?OHDA注射侧黑质致密部内多巴胺能神经元完全变性

为(106±15)ms，与正常组相比明显降低(P<0.02，图2B)。平均变异系数为0.63±0.04，与正常组相比显著升高(P<0.001，图2C)，提示6?OHDA毁损组大鼠PPN神经元的放电形式与正常组相比不规则程度增加。从PPN神经元各种放电形式所占百分比可以看出，6?OHDA损毁组大鼠PPN神经元的放电形式明显趋于不规则;规则放电神经元的百分比减少到21%，而不规则放电神经元增至64%(P<0.001);另有15%的神经元表现出爆发式放电(图2D)。

　　2.2 Oxo?M对正常组和6?OHDA损毁组大鼠PPN神经元电活动的影响 在6只正常大鼠PPN内注射200nL盐水作为实验对照。盐水注射前和注射后PPN神经元的平均放电频率分别为(11.5±2.2)spikes/s和(12±2.3)spikes/s，注射前后无显著性差异(n=6，P=0.2)。PPN内局部注射Oxo?M对正常组和6?OHDA损毁组大鼠PPN神经元的电活动均产生了兴奋、抑制和无变化3种结果。在正常组大鼠，Oxo?M兴奋了11个神经元，抑制了13个神经元的电活动，对4个神经元则无明显影响(图3A～3D;表1)。这些神经元在局部注射前的平均放电频率为(8.1±1.1)spikes/s，注射后增加到(13.2±4.0)spikes/s，注射前后的平均放电频率无显著性差异(n=28，P=0.2;图3E)。与正常组相比，6?OHDA毁损组大鼠在PPN内注射Oxo?M后，有3个神经元的放电频率增加，29个神经元的放电频率降低，1个神经元的放电频率无明显变化(图4A～4D;表1)。Oxo?M局部注射前6?OHDA毁损组的平均放电频率为(13.1±2.2)spikes/s，注射后平均放电频率降低到(8.0±2.2)spikes/s，与注射前相比有显著差异(n=33，P<0.0001;图4E)。局部注射Oxo对正常组和6?OHDA毁损组大鼠PPN神经元的放电形式均无显著影响。表1 正常和损毁大鼠PPN神经元对M受体激动剂的不同反应

　　3 讨 论

　　本研究结果显示黑质纹状体通路单侧损毁后大鼠PPN神经元的放电频率增加，放电形式趋于不规则。这些结果与以往的报道相类似[3]。在PPN内注射M受体激动剂Oxo?M对正常大鼠和6?OHDA毁损大鼠PPN神经元放电均产生了兴奋、抑制和无变化三种不同的效果。这表明Oxo?M对PPN神经元的作用较为复杂，可能不仅涉及突触后M受体，也涉及突触前受体和其他传入纤维的调节。在PPN神经元上有胆碱能M2、M3和M4受体亚型的表达，并且M2受体的密度最高;M2受体主要是作为自身受体表达于胆碱能神经元，但它也表达在一些非胆碱能神经元及其他传入纤维末梢[5,8]。M2受体与腺苷酸环化酶呈负性耦联。它被M2受体激动剂激活后可抑制神经元的活性及递质释放[5]。在本研究中发现，正常大鼠给予Oxo?M局部注射后部分神经元放电频率明显降低。这可能是由于突触后M2受体的激活抑制了PPN神经元的活动。另外，PPN接受来自STN和额叶皮层的兴奋性谷氨酸能神经纤维[1?2]，M2受体表达于这些谷氨酸能神经纤维的末梢，且突触前M2受体的激活可抑制相应递质的释放[9]。如果M2受体表达于PPN的谷氨酸纤维末梢，这可能是引起Oxo?M抑制PPN神经元电活性的间接机制。至于正常大鼠部分PPN神经元在局部注射后电活性增高的原因尚不清楚。PPN的胆碱能传入纤维主要来自对侧PPN和同侧隔核的背外侧，而γ?氨基丁酸能传入纤维则来自于SNr和EP[1]。研究表明纹状体的胆碱能和γ?氨基丁酸能纤维末梢均表达M2受体，且该受体的激活抑制乙酰胆碱和γ?氨基丁酸的释放[9?10]。因此，可以推测PPN胆碱能和γ?氨基丁酸能纤维末梢M2受体的激活可抑制乙酰胆碱和γ?氨基丁酸的释放，从而间接兴奋PPN神经元。另外，M3受体亦表达于少部分PPN神经元，且该受体的激活可增加神经元的放电频率[9]。这也是PPN神经元活性增强的可能原因之一。

　　本研究结果显示6?OHDA损毁后大鼠PPN神经元活动增加，且趋于不规则，大部分PPN神经元可被M型胆碱能受体激动剂Oxo?M抑制。除上述M受体的激活抑制正常大鼠PPN神经元的放电频率所涉及的机制外，我们推测6?OHDA损毁大鼠PPN神经元活动的增加及Oxo?M对神经元的抑制作用还与STN和额叶皮质的兴奋性谷氨酸能传入纤维有关。电生理和代谢研究发现刺激STN、损毁STN或药物阻断均可缓解PD动物模型和PD患者的运动症状[4,11]，说明在PD状态下STN的活动是增强的。纹状体多巴胺能传入纤维的缺失可导致纹状体内皮质?纹状体通路谷氨酸释放增加，导致谷氨酸浓度升高。而且，我们最近的研究发现6?OHDA损毁大鼠内测前额叶皮质锥体神经元处于过度活动状态[7,12]。此外，在体电生理记录发现SNc损毁后，由谷氨酸介导的纹状体神经元突触后电位显著增强[13]。这些研究结果提示PD的病理生理机制与谷氨酸能神经元的过度激活有直接关系。STN和额叶皮层的兴奋性谷氨酸能传入纤维是6?OHDA损毁大鼠PPN神经元活性增加的主要原因。过度活动的谷氨酸能传入纤维上的突触前M型胆碱能受体在被Oxo?M激活后，抑制了谷氨酸的释放，从而使PPN神经元的活动降低。

　　本研究结果显示6?OHDA毁损组大鼠PPN神经元处于过度活动状态。M胆碱能受体的激活对正常和6?OHDA损毁大鼠的PPN神经元均产生了不同的影响。M受体激动剂对PPN神经元的作用主要涉及到M2受体亚型在PPN的不同作用位点，并与谷氨酸能、胆碱能和γ?氨基丁酸能传入纤维的调节有关。从本研究结果可以看出，兴奋性谷氨酸能传入纤维对PD大鼠PPN神经元电活动的调节起着重要的作用。然而，M2受体亚型在PPN内的具体分布尚不清楚，明确这些受体作用位点将会帮助我们进一步解释上述现象。