Ang?2和Tie?2在食管鳞癌患者肿瘤组织中的表达及意义

 食管鳞癌(ESCC)是常见的消化系统恶性肿瘤，死亡率较高，严重威胁人民健康与生命。食管癌浸润、转移是引起死亡的主要原因，尤其血管生成是食管癌发生侵袭和转移的关键点。血管生成素/内皮细胞酪氨酸激酶受体系统(Angiopoietins/Tie?2)是近年来发现的在血管新生过程中调节血管生成、重塑并影响其成熟和稳定性的一类重要配体/受体系统，其生物学行为和作用机制尚在探索之中〔1〕。本研究旨在探讨血管生成素?2(Ang?2)及其受体即酪氨酸激酶受体?2(Tie?2)的表达与食管鳞癌组织中血管生成的关系，并用CD105标记肿瘤组织微血管密度(MVD)。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 收集我院1990年1月至1998年12月手术切除食管鳞癌标本72例，均为原发食管鳞癌并均进行了食管鳞癌手术治疗。男性43例，女性29例;年龄42～79岁，平均年龄60岁。癌组织浸及黏膜及黏膜下11例，浸及肌层30例，浸及浆膜或浆膜外31例;无淋巴结转移43例，有淋巴结转移29例。根据国际抗癌联盟(UICC)的TNM分期标准进行临床分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期25例，Ⅲ期23例，Ⅳ期8例。资深病理医师对切片进行复习确诊，高分化鳞癌28例，中分化鳞癌32例，低分化鳞癌12例。另选取22例正常食管组织作为对照。

　　1.2 免疫组织化学染色 所有标本经10%甲醛常规固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。Ang?2(兔抗人单克隆抗体，稀释浓度1∶50)和Tie?2(兔抗人单克隆抗体，稀释浓度1∶50)均为武汉博士德生物工程有限公司产品;CD105(鼠抗人单克隆抗体，即用型)、SP试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥公司。按免疫组化操作规程进行，用已知阳性乳腺癌标本作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 结果判断

　　1.3.1 Ang?2和Tie?2的判定标准 Ang?2和Tie?2均以肿瘤细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，以综合染色强度和阳性细胞所占的百分比作为评价标准，在400倍视野下计数500个细胞，其中染色深度以多数细胞的呈色反应为准：不着色0分，浅黄色1分，棕黄色1分，深棕色3分;再将染色阳性细胞的百分比打分，阴性为0分，阳性细胞≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，染色强度和阳性百分比的乘积>3分认定为免疫反应阳性。

　　1.3.2 肿瘤MVD的判定标准 CD105标记微血管，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管。CD105阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准，计数方法采用Sonja等〔2〕介绍的方法，先在低倍(×100)镜下全面观察整个视野，选择CD105染色阳性内皮细胞最多、微血管形成最丰富的区域，然后转至高倍镜下(×400)计数3个视野的微血管数，每张切片上都随机选择10个不同高倍视野，计数MVD，取其平均值。工程师论文发表

　　1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，组间比较采用χ2检验分析，相关性采用Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 食管鳞癌组织及癌旁正常组织中Ang?2和Tie?2的表达 Ang?2和Tie?2阳性均定位于肿瘤细胞胞质内，食管鳞癌组织Ang?2表达阳性率77.8%(56/72)，癌旁正常组织Ang?2表达阳性率34.4%(7/22);Tie?2表达阳性率73.6%(53/72)，癌旁正常组织Tie?2表达阳性率27.3%(6/22)。结果表明，Ang?2和Tie?2在食管鳞癌组织中表达均较正常组织高，两者差异均显著(P<0.01)。
2.2 Ang?2和Tie?2表达与食管鳞癌临床病理特征的关系 Ang?2与Tie?2表达水平与患者性别、年龄和分化程度无关，与癌组织浸润程度、淋巴结转移及临床分期相关(均P<0.05)，见表1。

　　2.3 Ang?2、Tie?2与MVD的关系 CD105标记的新生血管内皮细胞主要位于癌组织周边部位,以细胞膜和细胞质着色,呈棕黄色颗粒状，可形成明显的管腔,且癌组织中壁厚腔大的非新生血管内皮细胞中CD105弱表达甚至不表达。CD105标记的MVD在56例Ang?2阳性表达食管鳞癌组织中表达为40例，MVD计数为24.17±3.17， CD105标记的MVD在16例Ang?2阴性表达食管鳞癌组织中表达为7例， MVD计数为29.64±3.90， Spearman秩相关分析结果，Ang?2表达与MVD呈正相关(r=0.768 9 ，P<0.05)。CD105标记的MVD在53例Tie?2阳性表达食管鳞癌组织中表达为37例， MVD计数为20.09±2.06，CD105标记的MVD在19例Tie?2阴性表达食管鳞癌组织中阳性表达仅为7例，MVD计数为25.68±3.43，Spearman秩相关分析结果，Tie?2表达与MVD呈正相关(r=0.863 4，P<0.05)。表1 Ang?2和Tie?2在食管鳞癌中的阳性表达率

　　3 讨 论

　　肿瘤的生长主要依赖血管的供应，同时肿瘤血管也是肿瘤细胞向其他组织和器官转移的重要途径。故肿瘤血管的形成对于肿瘤的生长和发挥其生物学特性起着至关重要的作用。而许多因素都参与肿瘤的血管生成。血管生成素(Ang)是一类与血管生成密切相关的蛋白质，其主要成员包括Ang?1，Ang?2，Ang?3和Ang?4〔3〕，均能识别同一受体Tie?2。

　　Ang?2主要参与新生血管的成熟及维持血管稳定性，是肿瘤血管新生的关键因素〔4，5〕。在肿瘤发生的早期，Ang?2参与破坏瘤体周围宿主的正常血管，而促进肿瘤新生血管的生成，在瘤体周边形成所谓的血管共择区。当肿瘤形成以后，Ang?2与血管内皮生长因子(VEGF)有协同作用，共同促进肿瘤血管生成，并阻碍血管的成熟性和稳定性。Tsutsui 的研究表明Ang?2在肿瘤的血管新生中作用明显，它特异表达于肿瘤组织的血管重建区并参与肿瘤血管的新生，从而影响肿瘤的生长和转移〔6〕。本研究也证实Ang?2在食管鳞癌组织呈强阳性表达，尤其在富含血管的中晚期食管鳞癌组织中。同时我们还发现癌组织的边缘有大量管壁不完整、管腔不规则的新生血管出现且Ang?2表达强阳性，表明Ang?2在诱导肿瘤血管形成中起着重要的作用。工程师论文发表

　　Tie?2是一种能够特异性表达于内皮细胞上的酪氨酸激酶型受体。当Ang?2与Tie?2结合可破坏血管结构的完整性，导致内皮细胞之间、内皮细胞与支持细胞之间的相互作用减弱，由此引起毛细血管出芽，形成不成熟的、无血管周细胞包绕的新血管。有文献报道在肺癌组织中Ang?2及Tie?2也存在过度表达，表明二者对肺癌肿瘤血管新生也可能起着调节作用〔7〕。我们的研究结果显示，Tie?2不仅表达血管内皮细胞上，而且在食管鳞癌组织中表达率较高，这可能是Tie?2作为Ang?2的受体并与Ang?2共同成为肿瘤血管新生起始及加强的因素〔8〕。

　　为探讨Ang?2和Tie?2表达在食管鳞癌演进中的作用，我们进一步分析了Ang?2和Tie?2表达与食管鳞癌各临床病理指标的关系。我们的研究提示Ang?2和Tie?2可能通过食管鳞癌的血管生成来调节其生物学行为。食管鳞癌的血管新生是一复杂的过程，Ang?2/Tie?2发挥了重要作用，同时研究二者的临床病理特征，有利于我们进一步了解食管鳞癌的发生和转移机制，为食管鳞癌抗血管治疗开辟了新途径，也为临床判断食管鳞癌患者的预后提供有价值的分子指标。