用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体

关键字：  啮齿动物 
　　查菲埃立克体是1987年报道的人单核细胞埃立克体病的病原体［1］，于1991年在美国被分离鉴定和定名［2］。该病临床表现主要为发热、头痛、肌痛，实验室检查有白细胞减少、血小板减少和转氨酶升高。现已证明美洲花蜱（Amblyomma americanum）和变异革蜱（Dermacentor variabilis）可以作为查菲埃立克体的传播媒介，白尾鹿（Odocoileus virginianus）可能是其动物宿主［3］。目前报道的病例主要分布于美国南部，在欧洲、非洲亦有病人出现，我国尚无该病例的报道，但南方很多地区的自然环境、气候条件及蜱种均与美国该病流行区极为相似，在云南和福建的蜱中检测到查菲埃立克体DNA特异片段［4］。为了解这些地区是否有查菲埃立克体自然疫源地的存在，及蜱类和野生动物的感染情况，我们应用半套式PCR技术，检测蜱及野生动物中查菲埃立克体DNA，对特异片段克隆后，进行序列分析，现将结果报告如下：
　　1　材料和方法
　　1.1　现场情况　调查点位于闽西北武夷山南麓山地，海拔300～700m，年平均温度为17.6℃，相对湿度80％左右，年降雨量1600mm，植被以针、阔混交林为主，山多林深，气候湿润，是动物繁殖和昆虫孳生的适宜场所，存在多种自然疫源性疾病。
　　1.2　标本的收集　蜱标本系1997～1998年间从林区草丛采集的游离蜱及从家畜和野生动物宿主（山麂、山羊、野猪、野兔、狗、牛、狐狸等）体表捉到的寄生蜱，共计755只，经鉴定，按种类和宿主分组检测。野鼠和野兔系同期在该地捕获，现场解剖，取脾和血块冷藏保存，脾脏39份，血块35份。野生动物种类及数量见表1。
　　1.3　PCR引物　参照文献［5、6］　构建查菲埃立克体16S rRNA基因特异引物，外引物HE1和PER2可扩增587bp的片段，HE1和HE3进行半套式PCR可扩增390bp的片段，引物的序列如下（根据M73222）：
　　HE1（49-77）5?-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3?
　　HE3（438-412）5?-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3?
　　PER2（635-613）5?-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3?
　　引物由军事医学科学院生物工程研究所合成。
　　1.4　PCR模板的制备
　　1.4.1　蜱标本　将蜱用75％的酒精浸泡30min后，用无菌生理盐水洗3次，吸血蜱1只1组，未吸血蜱2只或5只1组，用研磨器研碎，加入含蛋白酶K 100μg／ml的TE 300μl，55℃水浴1h，用酚：氯仿法抽提，两倍体积无水乙醇沉淀，70％酒精洗涤，干燥后，加50μlTE溶解，－20℃贮存备用。
　　1.4.2　野鼠脏器及血块标本　以无菌操作取野鼠脾脏3mm见方小块，用研磨器研碎（冻融的血取100μl），加蛋白酶K消化液（0.1m M Tris-Cl pH8.0，0.5μm EDTA pH8.0，0.5％ SDS，100μg／ml蛋白酶K）300μl，55℃水浴3h，中间多次振荡，至清亮无可见组织块，抽提及以后步骤同蜱标本处理。
　　1.5　PCR扩增　第一轮扩增，取上述DNA模板3μl，10×PCR缓冲液3μl，引物（HE1和PER2）浓度为0.1μmol／L，dNTPs 50μmol／L，总反应体积为30μl。扩增条件：95℃预变性180s，94℃ 60s，56℃ 75s，72℃ 70s扩增35个循环，最后72℃延伸7min。取第一轮扩增产物1μl为模板进行第二轮扩增，方法条件均同第一轮（引物为HE1和HE3）。两轮产物各取10μl，用含溴化乙锭的1.4％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
　　1.6　PCR产物的克隆与序列测定　用低熔点琼脂糖凝胶法回收第二轮PCR扩增产物，经纯化，连接到pGEM-T载体（美国Promega公司产品）上；将重组质粒转化感受态宿主E.coli XL1-blue（美国Ivitogens公司产品），转化子在含X-gal和IPTG（美国Promega公司产品）的平板上以蓝、白斑法筛选。挑取白色菌落，以HE1和HE3为引物做PCR快速鉴定，取阳性克隆，液体培养增菌；用QIApreg试剂盒（德国QIAGEN公司产品）提取双链重组质粒DNA，应用373A自动测序仪测序。
　　1.7　DNA同源性比较　通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心（NCBI）站点后，利用BLAST工具，与GenBank中注册的核苷酸序列进行比较。
　　2　结果
　　2.1　蜱标本检测结果　对不同来源的蜱标本先分批进行检测然后统一进行试验，重复检测的结果与分批检测的结果一致性良好。对个别结果有差异的标本，再进行第三次试验，以最后一次结果为准。从福建山麂、山羊、野兔、水牛体表采集的越原血蜱成蜱及从草地采集的游离越原血蜱成蜱标本中扩增出目的DNA片段（图1）。共检测越原血蜱成蜱616只（240组），31组阳性，按每组至少有1只蜱阳性计算，则最小阳性率为5.0％。检测卵形硬蜱成蜱68只，中华硬蜱成蜱23只，豪猪血蜱成蜱14只，粒形硬蜱成蜱4只，均未检出查菲埃立克体DNA。检测越原血蜱若蜱30只，结果均为阴性。
　　2.2　动物脏器及血块标本检测结果　共检测野鼠脾脏标本39份，有22份阳性，阳性率为56.4％。检测上述野鼠的血块标本共31份，13份（38.7％）阳性。脾脏和血块均阳性的鼠有8只。6种鼠中，社鼠的检出阳性率最高。另外，检测野兔血块标本4份，2份为阳性（表1）。代表性标本扩增产物电泳结果。
　　2.3　测序分析及结果　选择越原血蜱阳性标本2份，野鼠脾脏和血块阳性标本各1份，经半套式PCR扩增后，对390bp的DNA片段进行克隆和序列测定。4份标本测序结果完全一致。将测定的DNA序列输入BLAST分析程序，在GenBank中搜索，进行最大同源性比较，结果发现与查菲埃立克体美国分离株16SrRNA基因对应片段完全一致。
　　3　讨　论
　　PCR用于查菲埃立克体研究领域国内外均有报道，但是将此种半套式PCR技术应用于流行病学调查，检测现场野生动物内脏及血块中的查菲埃立克体国内尚未见报道。从16Sr RNA基因序列高变区构建的针对查菲埃立克体的特异引物HE1和PER2及HE3，具有很高的特异性，仅能扩增查菲埃立克体DNA，而对其它埃立克体种16S rRNA基因都不能扩增［5］。用此半套式PCR技术检测现场采集的越原血蜱、野鼠脾脏和血块及野兔血块，结果均获得了查菲埃立克体特异的DNA片段，而从人粒细胞埃立克体及斑点热立克次体DNA中扩增不出特异片段。同时，用有限稀释法，对这两对引物的半套式PCR敏感度进行评价，结果显示：最低能检测到4个拷贝的查菲埃立克体DNA。由于查菲埃立克体为专性细胞内寄生菌，分离培养甚为困难。极大地限制了对它的研究。因此，对于这种一般实验室难以检测而且分离成功率极低的病原体，半套式PCR及序列测定技术具有快速、简便、灵敏、特异，对原始材料要求不高的特点，为直接在蜱和野生动物中检测和鉴定查菲埃立克体提供了有力的手段。
　　本次及以前的研究［4］中，从野外采集的越原血蜱中检测到查菲埃立克体DNA，是该种蜱自然感染的有力证据。越原血蜱是当地的优势蜱种，在我们采集到的蜱中占83.7％，作为传播媒介的可能性很大。5.0％的最小阳性率与以前报道的4.3％的差别可能与样本量及蜱中存在的抑制查菲埃立克体16S rRNA基因扩增的物质有关。因此，今后基于PCR的蜱查菲埃立克体DNA调查应多检测单只蜱，以更准确地估计感染率。
　　本次调查野鼠脾脏及动物血块中查菲埃立克体DNA阳性率分别为56.4％和38.7％，J.Mitchell Lockhart等检测美国佐治亚州22只白尾鹿脾脏及外周血的查菲埃立克体DNA阳性率分别为41％和18％［7］，因为地域不同，宿主动物不同，标本量不同，差别大是可能的，但在脾脏中比血块中检出率高这一点上两者是一致的。这表明调查点鼠类及野兔可能感染查菲埃立克体，它们作为贮存宿主的可能性值得重视。同时，因为越原血蜱常寄生于牛、山羊等大型动物上，所以它们作为贮存宿主的可能性也不排除。因本次调查采集到的动物种类及数量均较少，缺少对人群的调查，所以更细致全面的流行病学调查还要继续进行。
　　总之，本研究结果说明，福建省可能存在查菲埃立克体的自然疫源地，越原血蜱和野鼠、野兔可能分别为其传播媒介和贮存宿主，但应进一步从蜱类和野生动物及病人分离病原体，才能证实。然而，在该地区及具有类似生境和蜱种的地区，临床医生如遇有蜱咬后发热，伴有白细胞减少，血小板减少和转氨酶升高的病人，应考虑到埃立克体感染的可能性，建议应用四环素类药物进行治疗，以免延误，造成严重后果。